Modelli acuti e cronici di iperglicemia in Zebrafish: un metodo per valutare l'impatto dell'iperglicemia sulla neurogenesi e la biodistribuzione delle molecole radiomarcate

Summary

Questo lavoro descrive metodi per stabilire modelli iperglicemia acuta e cronica in zebrafish. L'obiettivo è quello di indagare l'impatto dell'iperglicemia sui processi fisiologici, come la neurogenesi costitutiva e indotta da lesioni. Il lavoro evidenzia anche l'uso di zebrafish per seguire molecole radiomarcate (qui, [ ¹⁸ F] -FDG) usando PET / CT.

Abstract

L'iperglicemia è un importante problema di salute che porta alla disfunzione cardiovascolare e cerebrale. Per esempio, è associato ad un aumento dei problemi neurologici dopo l'ictus ed è dimostrato che pregiudica i processi neurogenici. È interessante notare che lo zebrafish adulto è emerso recentemente come un modello pertinente e utile per imitare l'iperglicemia / diabete e per indagare la neurogenesi costitutiva e rigenerativa. Questo lavoro fornisce metodi per sviluppare i modelli zebrafish di iperglicemia per esplorare l'impatto dell'iperglicemia sulla proliferazione delle cellule cerebrali in condizioni di homeostatico e di riparazione del cervello. L'iperglicemia acuta viene stabilita usando l'iniezione intraperitoneale di D-glucosio (2,5 g / kg di peso corporeo) in zebrafish adulti. L'iperglicemia cronica è indotta da immersione di zebrafish adulti in D-glucosio (111 mM) contenenti acqua per 14 giorni. Sono descritte misure di livello glucosio nel sangue per questi diversi approcci. Metodi per indagare l'impatto della iperglicemia sui fattori costitutivi aLa neurogenesi rigenerativa, descrivendo la lesione meccanica del telencephalon, dissecting il cervello, incorporando paraffina e sezionando con un microtomo, e eseguendo procedure immunohistochemistry, sono stati dimostrati. Infine, viene descritto anche il metodo di utilizzare il pesce zebra come modello rilevante per studiare la biodistribuzione delle molecole radioattive (qui, [ ¹⁸ F] -FDG) utilizzando PET / CT.

Introduction

L'iperglicemia è definita come livelli eccessivi di glucosio nel sangue. Anche se potrebbe riflettere una situazione di stress acuto, l'iperglicemia è anche una condizione che spesso porta a una diagnosi di diabete, un disturbo cronico di secrezione insulina e / o resistenza. Nel 2016, il numero degli adulti che vivono con il diabete ha raggiunto 422 milioni di persone in tutto il mondo, e ogni anno 1,5 milioni di persone muoiono da questa malattia, rendendolo un grave problema di salute ¹ . Infatti, il diabete incontrollato porta a diversi disturbi fisiologici che interessano il sistema cardiovascolare, i reni e i sistemi nervosi peri....

Protocol

I pesci zebra degli animali selvatici adulti ( Danio rerio ) sono stati mantenuti in condizioni normali di fotoperiodo (14/10 h luce / scura) e temperatura (28 ° C). Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità alle direttive comunitarie francesi e comunitarie per l'uso degli animali nella ricerca (86/609 / CEE e 2010/63 / UE) e sono state approvate dal Comitato Etico locale per la sperimentazione animale.

1. Stabilire un modello di iperglicemia acuta in Zebrafish

1. Preparare una soluzione di base di tricaina (MS-222) sciogliendo 400 mg di polvere di tricina in 97,9 ml di acqua e 2,1 ml di tampone Tris / H....

Results

Utilizzando le procedure descritte in questo articolo, l'iniezione intraperitoneale di D-glucosio (2,5 g / kg di peso corporeo) è stata eseguita su zebrafish adulti e ha portato ad un significativo aumento dei livelli di glucosio nel sangue 1,5 h dopo l'iniezione ( Figura 1A ). 24 h dopo iniezione, i livelli di glucosio nel sangue erano simili tra D-glucosio e pesci iniettati da PBS ¹² . Per il trattamento cronico, i zebrafish sono st.......

Discussion

Questo lavoro descrive diversi metodi per stabilire modelli acuti e cronici di iperglicemia nel pesce zebra. I principali vantaggi di queste procedure sono: (1) consentono una riduzione del numero di mammiferi utilizzati per la ricerca; (2) sono semplici da impostare e veloci da attuare; e (3) sono economici. Pertanto, tali modelli consentono di investigare l'impatto dell'iperglicemia su un gran numero di animali per studiarne l'impatto su diversi processi fisiologici, tra cui l'aterotrombosi, le disfunz.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1mL Luer-Lok Siringa	BD, USA	309628
4',6'-diamidino-2-fenilindolo (DAPI)	Sigma-Aldrich, Germania	D8417
7 mL contenitore bijou laboratorio semplice	Dutscher, Francia	080171
D-glucosio	Sigma-Aldrich, Germania	67021
Fotocamera digitale	Life Sciences, Giappone	Hamamatsu ORCA-ER
Stampi base monouso	Simport, Canada	M475-2
Asino anti-coniglio Alexa fluor 488	Life Technologies, USA	A21206
Centro di inclusione	Thermo Scientific, USA	Shandon Histocentre 3
Microscopio a fluorescenza	Nikon, Giappone	Eclipse 80i
Fluorodesossiglucosio (18F-FDG)	Ciclotrone, Francia
Striscia reattiva per glucometro	LifeScan, Francia	One-Touch 143 Ultra
Goat anti-mouse Alexa fluor 594	Life Technologies, USA	A11005
In-Vivo Sistema di imaging	TriFoil Imaging, Canada	Triumph Trimodalità
Microtomo	Thermo Scientific, USA	Microm HM 355 S
Mouse monoclonale anti-PCNA	DAKO, USA clone	PC10
Paraformaldeide (PFA)	Sigma-Aldrich, Germany	P6148-500G
Coniglio policlonale anti-GFAP	DAKO, USA
Banco di essiccazione per vetrini	Elettrotermico, USA	MH6616
Cloruro di sodio	Sigma-Aldrich, Germania	S9888
Citrato di sodio sale trisodico disidratato	Prolabo, Francia	27833.294
Ago sterile	BD Microlance 3	30 G 1/2 ; 0,3 mm&volte; 13 mm
Studente Dumont #5 Pinze	Strumenti per le scienze fini	91150-20
Forbici chirurgiche per studenti	Strumenti per le scienze fini	91400-14
Superfros Plus Gold Slides	Thermo Scientific, USA	FT4981GLPLUS
Microscopio operatorio	Leica, Francia	M320-F12
Cassette per inclusione tissutale	Simport, Canada	M490-10
Terreno per inclusione tissutale	LeicaBiosystems, USA	39602004
Toluene	Sigma-Aldrich, Germania	244511
Tricaina MS-222	Sigma-Aldrich, Germania	A5040
Triton X100	Sigma-Aldrich, Germania	X100-500 mL
Vectashield medium	Vector Laboratories, USA	H-1000
Xylene	Sigma-Aldrich, Germania	534056
Fish Strain	AB
strong>Saline phosphate buffer (10X PBS) pH 7,4 (per 1 litro)			Per preparare 10X PBS, aggiungere i seguenti sali e completare a 1 litro con acqua
distillataCloruro di potassio (MM : 74,55 g/mol): 2,00 g	Sigma-Aldrich, Germania	746436
Fosfato di potassio monobasico (MM: 136,09 g/mol): 2,40g	Sigma-Aldrich, Germania	795488
Cloruro di sodio (MM : 58,44 g/mol): 80,00 g	Sigma-Aldrich, Germania	S9888
Sodio fosfato bibasico (MM: 141,96 g): 14,40 g	Sigma-Aldrich, Germania	795410