ゼブラフィッシュにおける高血糖症の急性および慢性モデル：高血糖が神経新生および放射性標識分子の生体内分布に及ぼす影響を評価する方法
Summary
この研究では、ゼブラフィッシュで急性および慢性の高血糖モデルを確立する方法について説明します。この目的は、構成的および傷害誘発性の神経発生のような生理学的過程に対する高血糖の影響を調べることである。この研究では、PET / CTを用いて放射標識分子（ここでは、[ 18 F] -FDG）を追跡するためのゼブラフィッシュの使用法が強調されています。
Abstract
高血糖は、心血管および大脳の機能不全をもたらす主要な健康問題である。例えば、脳卒中後の神経学的問題の増加に関連し、神経原性プロセスを損なうことが示されている。興味深いことに、成体ゼブラフィッシュは、高血糖症/糖尿病を模倣し、構成的および再生的な新形成を調べるために、関連性のある有用なモデルとして最近出現した。この研究は、恒常性および脳修復条件下での脳細胞増殖に対する高血糖の影響を調べるために、高血糖のゼブラフィッシュモデルを開発する方法を提供する。急性高血糖は、成人ゼブラフィッシュにD-グルコース（2.5g / kg体重）を腹腔内注射することにより確立される。慢性の高血糖は、成体ゼブラフィッシュを水を含むD-グルコース（111mM）に14日間浸漬することによって誘導される。これらの異なるアプローチについて、血糖値の測定値が記載されている。高血糖が構成的に及ぼす影響を調べる方法終脳の機械的傷害を記述し、脳を解剖し、パラフィン包埋し、ミクロトームで切片化し、免疫組織化学的手順を実施することによって再生神経発生を実証する。最後に、PET / CTを用いた放射標識分子（ここでは[ 18 F] -FDG）の生体内分布を研究するための関連モデルとしてゼブラフィッシュを使用する方法も記載されている。
Introduction
高血糖は、過剰な血糖値として定義される。急性ストレスの状況を反映することができるが、高血糖はまたしばしば糖尿病の診断、インスリン分泌および/または耐性の慢性障害につながる状態である。 2016年に糖尿病で暮らす成人の数は世界で4億2200万人に達し、毎年150万人がこの病気で死亡し、大きな健康問題となっています1 。実際、制御されていない糖尿病は、心臓血管系、腎臓、および末梢および中枢神経系に影響を及ぼすいくつかの生理学的障害を引き起こす。
興味深いことに、急性および慢性の高血糖は認知を変え、認知症およびうつ病の両方に寄与する可能性があります2,3,4,5,6。さらに、患者の入院高血圧症は、虚血性脳卒中後の機能的、神経学的、および生存の転帰に関連している7,8,9,10,11。高血糖症/糖尿病は、神経幹細胞の活動やニューロンの分化、移動、生存に影響を及ぼすことにより、成人の神経新生、新しいニューロンの生成につながる過程に影響を与えることも示された2,12。
哺乳動物とは対照的に、ゼブラフィッシュのようなテンポラリーフィッシュは、脳全体に強い神経性活動を示し、成人期の脳修復能力が13,14,15,16で顕著である。特に、このような能力は、neuの持続性のために可能であるラジアルグリアおよび神経芽細胞を含む幹/前駆細胞17,18,19。さらに、ゼブラフィッシュは、最近、肥満および高血糖症/糖尿病を含む代謝障害を研究するためのモデルとして出現した20,21,22。
ゼブラフィッシュは、高血糖および神経発生のよく知られたモデルであるが、脳恒常性および認知機能に対する高血糖の影響を研究している研究はほとんどない12,23。構成的および傷害誘発性の脳細胞増殖に対する高血糖の影響を決定するために、D-グルコースの腹腔内注射によって急性の高血糖モデルを作製した。さらに、魚を水に浸して慢性高血糖のモデルを再現したD-グルコース12 。ゼブラフィッシュは研究において多くの利点を示す。開発の最初の段階で安価で、持ちやすく、透明で、ゲノムの配列が決定されています。この研究の文脈において、それらはまた、いくつかのさらなる利点を示す：（1）それらは人間と同様の生理学的プロセスを共有し、それらを生物医学研究のための重要なツールにする。 （2）脳恒常性および神経新生に及ぼす高血糖の影響を迅速に調べることを可能にする。 （3）それらは代替モデルであり、研究に使用される哺乳類の数の減少を可能にする。最後に、ゼブラフィッシュは、PET / CTを用いた放射性標識分子および潜在的な治療薬の生体内分布を試験するためのモデルとして使用することができる。
次の手順の全体的な目標は、ゼブラフィッシュで急性および慢性の高血糖のモデルを設定する方法を視覚的に文書化し、zeb高血糖状態での脳のリモデリングを評価し、PET / CTを用いて放射能標識分子（ここでは[ 18 F] -FDG）をモニターすることができる。
Protocol
Representative Results
Discussion
この研究は、ゼブラフィッシュにおける急性および慢性の高血糖モデルを確立するための様々な方法を記載している。これらの手順の主な利点は、（1）研究に使用する哺乳類の数を減らすこと、（2）設置が簡単で迅速に実施できること、（3）経済的であることである。したがって、このようなモデルは、アテローム血栓症、心臓血管機能不全、網膜症、血液脳関門漏出、および構成的およ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、ビデオを編集するためのLa RUunion大学のDirection des Usages duNumérique（DUN）、ボイスオーバーのためのLynda-Rose Mottagan、校正のためのMary Osborne-Pellegrinに感謝します（特に、Jean-FrançoisFévrier、Eric Esnault、Sylvain Ducasse）ボイスオーバー、およびCYROIプラットフォームをサポートしています。この作品は、La RUunion大学（BonusQualitéRecherche、Dispositifs incitatifs）、ConseilRégionalde LaRéunion、欧州連合（CPER / FEDER）、およびPhilancia Associationからの助成金によって支えられました。 ACDは、ラ・レユニオン大学（コントラクト・ドクター）の国際学術院からのフェローシップ・グラントの受領者です。
Materials
| 1mL Luer-Lok Syringe | BD, USA | 309628 | |
| 4',6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Sigma-Aldrich, Germany | D8417 | |
| 7 mL bijou container plain lab | Dutscher, France | 080171 | |
| D-glucose | Sigma-Aldrich, Germany | 67021 | |
| Digital camera | Life Sciences, Japan | Hamamatsu ORCA-ER | |
| Disposable base molds | Simport, Canada | M475-2 | |
| Donkey anti-rabbit Alexa fluor 488 | Life Technologies, USA | A21206 | |
| Embedding center | Thermo Scientific, USA | Shandon Histocentre 3 | |
| Fluorescence microscope | Nikon, Japan | Eclipse 80i | |
| Fluorodeoxyglucose (18F-FDG) | Cyclotron, France | ||
| Glucometer test strip | LifeScan, France | One-Touch 143 Ultra | |
| Goat anti-mouse Alexa fluor 594 | Life Technologies, USA | A11005 | |
| In-Vivo Imaging System | TriFoil Imaging, Canada | Triumph Trimodality | |
| Microtome | Thermo Scientific, USA | Microm HM 355 S | |
| Monoclonal mouse anti-PCNA | DAKO, USA | clone PC10 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma-Aldrich, Germany | P6148-500G | |
| Polyclonal rabbit anti-GFAP | DAKO, USA | Z033429 | |
| Slide drying bench | Electrothermal, USA | MH6616 | |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich, Germany | S9888 | |
| Sodium citrate trisodium salt dehydrate | Prolabo, France | 27833.294 | |
| Sterile needle | BD Microlance 3 | 30 G 1/2 ; 0.3 mm x 13 mm | |
| Student Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Student surgical scissors | Fine Science Tools | 91400-14 | |
| Superfros Plus Gold Slides | Thermo Scientific, USA | FT4981GLPLUS | |
| Surgical microscope | Leica, France | M320-F12 | |
| Tissue embedding cassettes | Simport, Canada | M490-10 | |
| Tissue embedding medium | LeicaBiosystems, USA | 39602004 | |
| Toluene | Sigma-Aldrich, Germany | 244511 | |
| Tricaine MS-222 | Sigma-Aldrich, Germany | A5040 | |
| Triton X100 | Sigma-Aldrich, Germany | X100-500 mL | |
| Vectashield medium | Vector Laboratories, USA | H-1000 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich, Germany | 534056 | |
| Fish Strain | AB | ||
| Saline phosphate buffer (10X PBS) pH 7.4 (for 1 liter) | For preparing 10X PBS, add the following salts and complete to 1 liter with distilled water | ||
| Potassium chloride (MM : 74.55 g/mol): 2.00 g | Sigma-Aldrich, Germany | 746436 | |
| Potassium phosphate monobasic (MM: 136,09 g/mol): 2.40g | Sigma-Aldrich, Germany | 795488 | |
| Sodium chloride (MM : 58.44 g/mol): 80.00 g | Sigma-Aldrich, Germany | S9888 | |
| Sodium phosphate dibasic (MM: 141,96 g): 14,40 g | Sigma-Aldrich, Germany | 795410 |
Riferimenti
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