Akutte og kroniske modeller av hyperglykemi i sebrafisk: En metode for å vurdere virkningen av hyperglykemi på neurogenese og biodistribusjon av radiomerkede molekyler

Summary

Dette arbeidet beskriver metoder for å etablere akutte og kroniske hyperglykemodeller i sebrafisk. Målet er å undersøke effekten av hyperglykemi på fysiologiske prosesser, som konstitutiv og skadefremkalt neurogenese. Arbeidet fremhever også bruk av sebrafisk for å følge radiomerkede molekyler (her, [ ¹⁸ F] -FDG) ved hjelp av PET / CT.

Abstract

Hyperglykemi er et stort helseproblem som fører til kardiovaskulær og cerebral dysfunksjon. For eksempel er det forbundet med økte nevrologiske problemer etter slag og er vist å svekke nevogene prosesser. Interessant nok har den voksne zebrafisken nylig kommet fram som en relevant og nyttig modell for å etterligne hyperglykemi / diabetes og å undersøke konstitutiv og regenerativ neurogenese. Dette arbeidet gir metoder for å utvikle sebrafiskmodeller av hyperglykemi for å undersøke virkningen av hyperglykemi på hjernecelleproliferasjon under hjemmestatiske og hjernens reparasjonsbetingelser. Akutt hyperglykemi er etablert ved intraperitoneal injeksjon av D-glukose (2,5 g / kg kroppsvekt) til voksen sebrafisk. Kronisk hyperglykemi er indusert ved nedsenking av voksen sebrafisk i D-glukose (111 mM) som inneholder vann i 14 dager. Blodglukose-nivåmålinger er beskrevet for disse forskjellige tilnærmingene. Metoder for å undersøke effekten av hyperglykemi på konstitutiv aOg regenerativ neurogenese ved å beskrive telensfalonens mekaniske skade, dissekere hjernen, paraffininkonstruksjon og snitting med et mikrotom og utføre immunhistokjemeprosedyrer, blir demonstrert. Endelig beskrives også metoden for bruk av sebrafisk som en relevant modell for å studere biodistribusjon av radioaktive merkede molekyler (her, [ ¹⁸ F] -FDG) ved bruk av PET / CT.

Introduction

Hyperglykemi er definert som for høyt blodsukkernivå. Selv om det kan gjenspeile en situasjon med akutt stress, er hyperglykemi også en tilstand som ofte fører til diagnose av diabetes, en kronisk lidelse av insulinsekresjon og / eller motstand. I 2016 har antall voksne som lever med diabetes nådd 422 millioner over hele verden, og hvert år dør 1,5 millioner mennesker av denne sykdommen, noe som gjør det til et stort helseproblem ¹ . Faktisk fører ukontrollert diabetes til flere fysiologiske lidelser som påvirker kardiovaskulærsystemet, nyrene og perifere og sentrale nervesystemer.

Interessant kan akutt og kronisk hyperglykemi endre kognisjon og bidra til både demens og depresjon ^{2 , 3 , 4 , 5 , 6} . I tillegg er inntak av pasienter wI hyperglykemi er det blitt forbundet med dårligere funksjonelle, neurologiske og overlevelsesutfall etter iskemisk berøring ^{7 , 8 , 9 , 10 , 11} . Det ble også vist at hyperglykemi / diabetes påvirker voksen neurogenese, en prosess som fører til generering av nye nevroner, ved å påvirke nevrale stamcelleaktivitet og neuronal differensiering, migrasjon og overlevelse ^{2 , 12} .

I motsetning til pattedyr, viser teleostfisk, som sebrafisk, intensiv nevogenisk aktivitet gjennom hele hjernen og har en fremragende evne til hjernearbeid i voksen alder ^{13 , 14 , 15 , 16} . Spesielt er slike kapasiteter mulige på grunn av persistensen av neuRal stamme / stamceller, inkludert radial glia og neuroblaster ^{17 , 18 , 19} . I tillegg har zebrafisken nylig kommet fram som en modell for å studere metabolske forstyrrelser, inkludert fedme og hyperglykemi / diabetes ^{20 , 21 , 22} .

Selv om zebrafisken er en velkjent modell for hyperglykemi og nevrogenese, har få studier undersøkt virkningen av hyperglykemi på hjernens homeostase og kognitive funksjon ^{12 , 23} . For å fastslå effekten av hyperglykemi på konstitutiv og skadefremkalt hjernecelleproliferasjon ble en modell av akutt hyperglykemi opprettet ved intraperitoneal injeksjon av D-glukose. I tillegg ble en modell av kronisk hyperglykemi reprodusert ved nedsenkning av fisk i vann tilsatt wMed D-glukose ¹² . Sebrafisk har mange fordeler i forskning. De er billige, enkle å øke og gjennomsiktige i de første utviklingsstadiene, og deres genom er blitt sekvensert. I sammenheng med dette arbeidet viser de også flere flere fordeler: (1) de deler lignende fysiologiske prosesser med mennesker, noe som gjør dem til et kritisk verktøy for biomedisinsk forskning; (2) de tillater hurtig undersøkelse av virkningen av hyperglykemi på hjernens homeostase og neurogenese, gitt deres utbredt og sterk nevogenisk aktivitet; Og (3) de er en alternativ modell som gjør det mulig å redusere antallet pattedyr som brukes i forskning. Til slutt kan sebrafisk brukes som en modell for testing av biodistribusjon av radiomerkede molekyler og potensielle terapeutiske midler ved bruk av PET / CT.

Det overordnede målet med følgende prosedyre er å visuelt dokumentere hvordan man oppretter modeller av akutt og kronisk hyperglykemi i sebrafisk, bruk zebElektroish for å vurdere hjernemodellering i hyperglykemiske forhold og overvåke radiomerkede molekyler (her, [ ¹⁸ F] -FDG) ved bruk av PET / CT.

Protocol

Voksne wildtype zebrafish ( Danio rerio ) ble opprettholdt under standard fotoperiod (14/10 h lys / mørk) og temperatur (28 ° C) forhold. Alle eksperimenter ble utført i samsvar med retningslinjene for fransk og europeisk fellesskap for bruk av dyr i forskning (86/609 / EEC og 2010/63 / EU) og ble godkjent av det lokale etikkutvalget for dyreforsøk. 1. Etablere en modell for akutt hyperglykemi hos sebrafisk Forbered en stamløsning av tricaine (MS-222) ved å oppløse…

Representative Results

Ved bruk av prosedyrene beskrevet i denne artikkelen ble intraperitoneal injeksjon av D-glukose (2,5 g / kg kroppsvekt) utført på voksen sebrafisk og ført til en signifikant økning i blodsukkernivået 1,5 time etter injeksjon ( figur 1A ). 24 timer etter injeksjon var blodglukosenivåene like mellom D-glukose og PBS-injisert fisk 12 . For kronisk behandling ble sebrafisk nedsenket i D-glukose-vann (111 mM) og ble hyperglykemisk ve…

Discussion

Dette arbeidet beskriver ulike metoder for å etablere akutte og kroniske modeller av hyperglykemi hos sebrafisk. De viktigste fordelene ved disse prosedyrene er at: (1) de tillater reduksjon i antall pattedyr som brukes til forskning, (2) de er enkle å sette opp og raskt å implementere, og (3) de er økonomiske. Derfor tillater slike modeller undersøkelsen av virkningen av hyperglykemi på et stort antall dyr for å studere dens innvirkning på forskjellige fysiologiske prosesser, inkludert aterotrombose, kardiovask…

Materials

1mL Luer-Lok Syringe	BD, USA	309628
4',6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Sigma-Aldrich, Germany	D8417
7 mL bijou container plain lab	Dutscher, France	080171
D-glucose	Sigma-Aldrich, Germany	67021
Digital camera	Life Sciences, Japan	Hamamatsu ORCA-ER
Disposable base molds	Simport, Canada	M475-2
Donkey anti-rabbit Alexa fluor 488	Life Technologies, USA	A21206
Embedding center	Thermo Scientific, USA	Shandon Histocentre 3
Fluorescence microscope	Nikon, Japan	Eclipse 80i
Fluorodeoxyglucose (18F-FDG)	Cyclotron, France
Glucometer test strip	LifeScan, France	One-Touch 143 Ultra
Goat anti-mouse Alexa fluor 594	Life Technologies, USA	A11005
In-Vivo Imaging System	TriFoil Imaging, Canada	Triumph Trimodality
Microtome	Thermo Scientific, USA	Microm HM 355 S
Monoclonal mouse anti-PCNA	DAKO, USA	clone PC10
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich, Germany	P6148-500G
Polyclonal rabbit anti-GFAP	DAKO, USA	Z033429
Slide drying bench	Electrothermal, USA	MH6616
Sodium chloride	Sigma-Aldrich, Germany	S9888
Sodium citrate trisodium salt dehydrate	Prolabo, France	27833.294
Sterile needle	BD Microlance 3	30 G 1/2 ; 0.3 mm x 13 mm
Student Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	91150-20
Student surgical scissors	Fine Science Tools	91400-14
Superfros Plus Gold Slides	Thermo Scientific, USA	FT4981GLPLUS
Surgical microscope	Leica, France	M320-F12
Tissue embedding cassettes	Simport, Canada	M490-10
Tissue embedding medium	LeicaBiosystems, USA	39602004
Toluene	Sigma-Aldrich, Germany	244511
Tricaine MS-222	Sigma-Aldrich, Germany	A5040
Triton X100	Sigma-Aldrich, Germany	X100-500 mL
Vectashield medium	Vector Laboratories, USA	H-1000
Xylene	Sigma-Aldrich, Germany	534056
Fish Strain	AB
Saline phosphate buffer (10X PBS) pH 7.4 (for 1 liter)			For preparing 10X PBS, add the following  salts and complete to 1 liter with distilled water
Potassium chloride (MM : 74.55 g/mol): 2.00 g	Sigma-Aldrich, Germany	746436
Potassium phosphate monobasic (MM: 136,09 g/mol): 2.40g	Sigma-Aldrich, Germany	795488
Sodium chloride (MM : 58.44 g/mol): 80.00 g	Sigma-Aldrich, Germany	S9888
Sodium phosphate dibasic (MM: 141,96 g): 14,40 g	Sigma-Aldrich, Germany	795410