Modelos agudos y crónicos de la hiperglucemia en el pez cebra: un método para evaluar el impacto de la hiperglucemia en la neurogénesis y la biodistribución de las moléculas radiomarcadas

Summary

Este trabajo describe métodos para establecer modelos de hiperglucemia aguda y crónica en el pez cebra. El objetivo es investigar el impacto de la hiperglucemia sobre los procesos fisiológicos, tales como la neurogénesis constitutiva y la inducida por lesión. El trabajo también destaca el uso de pez cebra para seguir moléculas radiomarcadas (aquí, [ ¹⁸ F] -FDG) utilizando PET / CT.

Abstract

La hiperglucemia es un problema de salud importante que conduce a la disfunción cardiovascular y cerebral. Por ejemplo, se asocia con un aumento de los problemas neurológicos después del accidente cerebrovascular y se muestra que perjudica los procesos neurogénicos. Curiosamente, el pez cebra adulto ha emergido recientemente como un modelo relevante y útil para imitar la hiperglucemia / diabetes y para investigar la neurogénesis constitutiva y regenerativa. Este trabajo proporciona métodos para desarrollar modelos de hiperfeminismo de pez cebra para explorar el impacto de la hiperglucemia en la proliferación de células cerebrales bajo condiciones homeostáticas y de reparación cerebral. La hiperglucemia aguda se establece mediante la inyección intraperitoneal de D-glucosa (2,5 g / kg de peso corporal) en el pez cebra adulto. La hiperglucemia crónica se induce por inmersión de pez cebra adulto en D-glucosa (111 mM) que contiene agua durante 14 días. Se describen mediciones de nivel de glucosa en la sangre para estos diferentes enfoques. Métodos para investigar el impacto de la hiperglucemia sobreY la neurogénesis regenerativa, mediante la descripción de la lesión mecánica del telencéfalo, la disección del cerebro, la inclusión de parafina y la sección con un microtomo, y la realización de procedimientos inmunohistoquímicos. Finalmente, se describe también el método de utilizar el pez cebra como modelo relevante para estudiar la biodistribución de moléculas radiomarcadas (aquí, [18F] -FDG) utilizando PET / CT.

Introduction

La hiperglucemia se define como niveles excesivos de glucosa en la sangre. A pesar de que podría reflejar una situación de estrés agudo, la hiperglicemia es también una condición que a menudo conduce a un diagnóstico de diabetes, un trastorno crónico de la secreción de insulina y / o resistencia. En 2016, el número de adultos que viven con diabetes ha alcanzado 422 millones en todo el mundo, y cada año, 1,5 millones de personas mueren de esta enfermedad, por lo que es un problema de salud importante ¹ . De hecho, la diabetes no controlada conduce a varios trastornos fisiológicos que afectan al sistema cardiovascular, a los riñones y al sistema nervioso periférico y central.

Curiosamente, la hiperglucemia aguda y crónica puede alterar la cognición y contribuir a la demencia y la depresión ^{2 , 3 , 4 , 5 , 6} . Además, la admisión de pacientes wLa hiperglicemia se ha asociado con peores resultados funcionales, neurológicos y de supervivencia después del accidente cerebrovascular isquémico ^{7 , 8 , 9 , 10 , 11} . También se demostró que la hiperglucemia / diabetes afecta la neurogénesis de adultos, un proceso que conduce a la generación de nuevas neuronas, por el impacto de la actividad de las células madre neurales y la diferenciación neuronal, la migración y la supervivencia [ ^{2 , 12]} .

En contraste con los mamíferos, los peces teleósteos, como el pez cebra, muestran una intensa actividad neurogénica en todo el cerebro y muestran una capacidad excepcional para la reparación del cerebro durante la edad adulta ^{13 , 14 , 15 , 16} . Cabe destacar que estas capacidades son posibles debido a la persistencia de neuRal / células progenitoras, incluyendo glia radial y neuroblastos [ ^{17 , 18 , 19]} . Además, el pez cebra ha surgido recientemente como un modelo para estudiar los trastornos metabólicos, incluyendo obesidad e hiperglucemia / diabetes ^{20 , 21 , 22} .

Aunque el pez cebra es un modelo bien reconocido de hiperglucemia y neurogénesis, pocos estudios han investigado el impacto de la hiperglucemia sobre la homeostasis del cerebro y la función cognitiva ^{12 , 23} . Para determinar el impacto de la hiperglucemia sobre la proliferación de células cerebrales constitutivas y lesionadas, se creó un modelo de hiperglucemia aguda mediante la inyección intraperitoneal de D-glucosa. Además, se reprodujo un modelo de hiperglucemia crónica a través de la inmersión de peces en agua suplementada wCon D-glucosa ¹² . Zebrafish exhiben muchas ventajas en la investigación. Son baratos, fáciles de levantar y transparentes durante las primeras etapas de desarrollo, y su genoma ha sido secuenciado. En el contexto de este trabajo, también muestran varias ventajas adicionales: (1) comparten procesos fisiológicos similares con los humanos, haciéndolos una herramienta crítica para la investigación biomédica; (2) permiten una rápida investigación del impacto de la hiperglucemia sobre la homeostasis del cerebro y la neurogénesis, dada su amplia y fuerte actividad neurogénica; Y (3) son un modelo alternativo, que permite la reducción del número de mamíferos utilizados en la investigación. Finalmente, el pez cebra puede usarse como un modelo para probar la biodistribución de moléculas radiomarcadas y agentes terapéuticos potenciales usando PET / CT.

El objetivo general del siguiente procedimiento es visualizar visualmente cómo configurar modelos de hiperglucemia aguda y crónica en el pez cebra, use zebRafish para evaluar la remodelación cerebral en condiciones hiperglucémicas y monitorear las moléculas radiomarcadas (aquí, [ ¹⁸ F] -FDG) utilizando PET / CT.

Protocol

El pez cebra de tipo salvaje adulto ( Danio rerio ) se mantuvo en condiciones normales de fotoperiodo (14/10 h luz / oscuridad) y temperatura (28 ° C). Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las Directrices de la Comunidad Francesa y de la Comunidad Europea para el Uso de Animales en la Investigación (86/609 / EEC y 2010/63 / EU) y fueron aprobados por el Comité de Ética local para la experimentación con animales. 1. Establecimiento de un modelo de hiperglucemia agud…

Representative Results

Utilizando los procedimientos descritos en este artículo, se realizó una inyección intraperitoneal de D-glucosa (2,5 g / kg de peso corporal) en pez cebra adulto y se produjo un aumento significativo de los niveles de glucosa en sangre 1,5 h después de la inyección ( Figura 1A ). 24 h después de la inyección, los niveles de glucosa en sangre fueron similares entre D-glucosa y PBS inyectado de peces [ 12] . Para el tratamiento c…

Discussion

Este trabajo describe varios métodos para establecer modelos agudos y crónicos de hiperglucemia en el pez cebra. Las principales ventajas de estos procedimientos son: (1) permitir una reducción en el número de mamíferos utilizados para la investigación, (2) son fáciles de configurar y de implementar rápidamente, y (3) son económicos. Por lo tanto, estos modelos permiten investigar el impacto de la hiperglucemia en un gran número de animales para estudiar su impacto en diferentes procesos fisiológicos, incluye…

Materials

1mL Luer-Lok Syringe	BD, USA	309628
4',6'-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Sigma-Aldrich, Germany	D8417
7 mL bijou container plain lab	Dutscher, France	080171
D-glucose	Sigma-Aldrich, Germany	67021
Digital camera	Life Sciences, Japan	Hamamatsu ORCA-ER
Disposable base molds	Simport, Canada	M475-2
Donkey anti-rabbit Alexa fluor 488	Life Technologies, USA	A21206
Embedding center	Thermo Scientific, USA	Shandon Histocentre 3
Fluorescence microscope	Nikon, Japan	Eclipse 80i
Fluorodeoxyglucose (18F-FDG)	Cyclotron, France
Glucometer test strip	LifeScan, France	One-Touch 143 Ultra
Goat anti-mouse Alexa fluor 594	Life Technologies, USA	A11005
In-Vivo Imaging System	TriFoil Imaging, Canada	Triumph Trimodality
Microtome	Thermo Scientific, USA	Microm HM 355 S
Monoclonal mouse anti-PCNA	DAKO, USA	clone PC10
Paraformaldehyde (PFA)	Sigma-Aldrich, Germany	P6148-500G
Polyclonal rabbit anti-GFAP	DAKO, USA	Z033429
Slide drying bench	Electrothermal, USA	MH6616
Sodium chloride	Sigma-Aldrich, Germany	S9888
Sodium citrate trisodium salt dehydrate	Prolabo, France	27833.294
Sterile needle	BD Microlance 3	30 G 1/2 ; 0.3 mm x 13 mm
Student Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	91150-20
Student surgical scissors	Fine Science Tools	91400-14
Superfros Plus Gold Slides	Thermo Scientific, USA	FT4981GLPLUS
Surgical microscope	Leica, France	M320-F12
Tissue embedding cassettes	Simport, Canada	M490-10
Tissue embedding medium	LeicaBiosystems, USA	39602004
Toluene	Sigma-Aldrich, Germany	244511
Tricaine MS-222	Sigma-Aldrich, Germany	A5040
Triton X100	Sigma-Aldrich, Germany	X100-500 mL
Vectashield medium	Vector Laboratories, USA	H-1000
Xylene	Sigma-Aldrich, Germany	534056
Fish Strain	AB
Saline phosphate buffer (10X PBS) pH 7.4 (for 1 liter)			For preparing 10X PBS, add the following  salts and complete to 1 liter with distilled water
Potassium chloride (MM : 74.55 g/mol): 2.00 g	Sigma-Aldrich, Germany	746436
Potassium phosphate monobasic (MM: 136,09 g/mol): 2.40g	Sigma-Aldrich, Germany	795488
Sodium chloride (MM : 58.44 g/mol): 80.00 g	Sigma-Aldrich, Germany	S9888
Sodium phosphate dibasic (MM: 141,96 g): 14,40 g	Sigma-Aldrich, Germany	795410