Method Article

Sviluppo di un sistema di consegna economico DNA da "Acufection" e la sua applicazione alla ricerca della pelle

DOI:

10.3791/55206

⸱

April 19th, 2017

 ,  , 
1Graduate Institute of Immunology, National Taiwan University College of Medicine

In This Article

Summary

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Questo protocollo è un'alternativa economica per esprimere il DNA plasmidico nudo in pelle topo. L'obiettivo generale del protocollo è quello di consegnare i geni immuno-correlati nel tessuto della pelle di delineare il ruolo funzionale di un gene specifico in infiammazione cutanea.

Abstract

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Disregolazione della risposta immunitaria in pelle è associata a numerosi disturbi della pelle umana. Trasferimento diretto dei geni immuno-correlati nel tessuto della pelle è un approccio interessante per indagare la modulazione immunitaria di infiammazione cutanea in modelli murini di malattie umane. Qui vi presentiamo un protocollo costo-efficacia che ha trasportato DNA nudo in pelle mouse e porta alla espressione del transgene. Il metodo è coniato "acufection", che denota acu DNA puntura mediata fection trans. Per eseguire acufection, pelle di topo è stato infuso con il DNA in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS) e poi punge leggermente con un fascio di aghi per favorire l'assorbimento di DNA e trasfezione in cellule. Il DNA plasmidico è presumibilmente occupato da cheratinociti e cellule dendritiche (DC) nella pelle ed espresso in proteine. Puntura meccanico con il aghi per sé non ha causato danni alla pelle o indurre attivazione dei cheratinociti. L'espressionedei geni trasfettati è stato rilevato nella pelle sia a livello trascrizionale e traslazionale seguenti acufection per 2 giorni e mantenuto fino a 7 giorni. L'obiettivo primario per lo sviluppo di questo metodo acufection è stato quello di indagare su un'isoforma precedenza indefinito di IL-15. Usando questo metodo, un splicing alternativo IL-15 isoforma con parzialmente eliminato esone 7 (IL-15ΔE7) è stata espressa nella pelle e successivamente trattati con un recettore Toll-like 7 (TLR7) agonista, imiquimod (IMQ), per indurre infiammazione. Acufection consegnate IL-15ΔE7 in pelle soppressa proliferazione dei cheratinociti, spessore epidermico e il reclutamento di neutrofili nell'infiammazione cutanea IMQ-indotta. Con crescente interesse nell'identificazione dei meccanismi regolatori di infiammazione cutanea, il protocollo qui descritto fornisce un costo alternativo efficace e versatile al cannone gene o microseeding per la consegna del DNA in vivo. Essa può consentire potenzialmente scoperta della funzione di un romanzogene in pelle o per indagare nuovo trattamento per le malattie cutanee.

Introduction

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La pelle è la prima linea di difesa ospite. Cheratinociti (KC) sono il tipo di cellula importante nella pelle degli esseri umani e topi. In risposta a stimoli ambientali (per esempio luce solare, ossigeno, prodotti chimici e invasione patogeni), KC sono attivati e produrre una vasta gamma di citochine proinfiammatorie e chemochine, quali IL-8, IL-6, IL-1α, IL-1β, TNF α e GM-CSF 1. Insieme innescano il reclutamento di cellule immunitarie per la pelle. Infiammazione cutanea aggravata è spesso associata a numerose malattie umane compresi dermatite da contatto ectopica acuta e l'infiammazione mediata da cellule T cronica (es ....

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Protocol

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topi femmina a 8 - 12 settimane di età sono stati utilizzati per questo studio. C57 / BL6 wild-type (WT) e IL-15 carente (IL15 - / -) topi sono stati acquistati da National Laboratory Animal Centre (NLAC), Taiwan e Taconic Farm, rispettivamente. IL-15-deficienti (IL15 - / -) e IL-15-dominante (IL15 +/- e IL15 + / +) hanno mostrato un rapporto 1: 3 nella seconda generazione dalla croce di eterozigoti IL15 +/-. Il genotipo di IL-15 - / - mice è stata confermata da analisi PCR. I topi sono stati mantenuti nella struttura specifico patogeno libero (SPF) presso il Laboratorio Animal Center (LAC), National Ta....

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Results

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Mentre alcuni rossore era evidente entro la prima ora dopo puntura con aghi di agopuntura, la pelle liberata il giorno 2 ed è stata osservata alcuna reazione avversa cutanea fino al giorno 7 dopo puntura (Figura 2A). Ago che pungono indotto molto basso livello di epidermico orthokeratosis e infiltrazione dermica minima da H & E analisi comparata con la pelle non trattata (Figura 2B). Lo spessore epidermico

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Discussion

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La fase più critica per garantire l'espressione del DNA plasmidico è acufected ad oscillare in modo uniforme e allentare lo strato corneo della pelle. Spingendo gli aghi delicatamente senza tagliare la pelle, la forza dovrebbe essere abbastanza duro per deprimere la superficie. Per facilitare l'assorbimento del DNA in 10 microlitri soluzione su un 1 cm x 1 cm di superficie, gli aghi devono oscillare su e giù per circa 100 volte in 30 s. Si può determinare la forza che deve pungere la pelle e notando il numero di.......

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Disclosures

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Gli autori non hanno interessi finanziari da dichiarare.

Acknowledgements

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Questo lavoro è stato sostenuto dalla concessione da parte del Ministero della Scienza e della Tecnologia (MOST 103-2633-B-002-002, 104-2320-B-002-048). Ringraziamo Drs. Betty Wu-Hsieh e Chien-Kuo Lee al NTU, Leigh Zerboni presso la Stanford University e il dottor Peter Hoffmann presso l'Università delle Hawaii per la lettura del manoscritto, Yun Chien a NTU per l'assistenza tecnica, e il dottor Wen Wei-Chi in agricoltura biotecnologie Centro di ricerca presso Academia Sinica per un parere tecnico.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Accu Handy NeedleAccu36Gx0.5Dispositivo medico
NairTM LozioneChiesa & DwightN/A Utilizzareper rimuovere i peli
Shandon Xyline sostitutoThermo Fisher Scientific6764506Deparaffinizzazione
Avertin (2,2,2-Tribrometanolo)Sigma-AldrichT4,840-2Anestesia
2-metil-2-butanoloSigma-Aldrich152463Solvente per la dissoluzione dell'avertina
DifcoTM LB brodo, MillerBD244620Propagazione e mantenimento di E. coli per biologia molecolare
Complesso ELISA di topo IL-15/IL-15R Kit ELISA Ready-SET-GoeBioscience88-7215Misura la proteina IL-15
Anticorpo anti-topo Ly6GBioLegend127601utilizzato per la colorazione immunoistochimica
anti-topo Ki-67eBioscience14-5698-80Anticorpo utilizzato per colorante immunoistochimico
Simple Stain Mouse MAXPO (Rat)Nichirei Biosciences414341FReagente per bloccare il segnale di fondo nella colorazione topo su topo
Kit substrato DAB Perossidasi (HRP)Vector LaboratoriesSK-4100Substrato perossidato per colorazione immunoistochimica
Blocco Ultra VThermo Fisher ScientificTA-060-UBRidurre la colorazione di fondo aspecifica
Verde metileSigma-AldrichM8884Colorazione nucleare
Vecta MountTMVector LaboratoriesM-5000Conservazione permanente delle colorazioni istochimiche
Compresse cocktail di inibitori della proteasiRoche04-693-116-001Inibire l'attività della proteasi nel lisato cellulare
Crema Aldara3M ParmaceuticalsN/A5% crema imiquimod
Bessman Tissue PulverizerSpectrum Labs189475Utilizzo per polverizzare il tessuto cutaneo
ABI7900HT ciclatoreThermo Fisher ScientificN/ASaggio PCR quantitativo in tempo reale
VideocameraPanasonicHDC-SD60Documentazione dell'immagine
Axio Scope.A1ZEISSN/AMicroscopia a campo chiaro

References

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  1. Effendy, I., Loffler, H., Maibach, H. I. Epidermal cytokines in murine cutaneous irritant responses. Journal of applied toxicology : JAT. 20, 335-341 (2000).
  2. Nestle, F. O., Di Meglio, P., Qin, J. Z., Nickoloff, B. J. Skin immune sentinels in health and disease. Nature reviews....

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AcufectionDNA DeliveryMouse SkinPlasmid DNAAcupuncture NeedlesIL 15 IsoformTLR7 AgonistImiquimod TreatmentqRT PCR AnalysisImmunohistochemical Staining

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