Summary
Subretinal injeksjon er mye brukt i preklinisk studier av stilk cellen erstatning terapi for aldersrelatert makuladegenerasjon. I denne visualisert artikkelen beskriver vi en mindre risikabelt, reproduserbare og nøyaktig modifisert subretinal injeksjon teknikk via trans-Innbukking tilnærming til levere celler i rotte øyne.
Abstract
Degenerative retinal sykdommer som aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD) er den ledende årsaken til irreversible synstap over hele verden. AMD er preget av degenerering av netthinnens pigment (RPE) epitelceller, som er en monolayer av celler funksjonelt støtte og anatomisk innpakning rundt neural netthinnen. Gjeldende farmakologiske behandlinger for ikke-neovascular AMD (tørr AMD) bare senke progresjonen av sykdommen, men kan ikke gjenopprette visjon, nødvendiggjør studier identifisere romanen strategier. Erstatter degenerative RPE cellene med friske celler har lov å behandle tørr AMD i fremtiden. Omfattende prekliniske studier av stilk cellen erstatning terapi for AMD innebære transplantasjon av Stamcelle-avledet RPE celler i subretinal plass dyr modeller, som subretinal injeksjon teknikken brukes. Fremgangsmåten som hyppigst brukes i disse prekliniske dyrestudier er gjennom trans-Innbukking ruten, som gjort vanskelig for direkte visualisering av nålen slutten og kan ofte føre retinal skade. En alternativ tilnærming gjennom linsen tillater direkte observasjon av p enden posisjon, men det bærer en høy risiko for kirurgiske traumer som mer øye vev er forstyrret. Vi har utviklet en mindre risikabelt og reproduserbar endret trans-Innbukking injeksjon metode som bruker definerte nål vinkler og dybder vellykket og konsekvent levere RPE celler i rotte subretinal plass og unngå overdreven retinal skade. Celler levert på denne måten har tidligere vist for å være effektiv i Royal College of Surgeons (RCS) rotta for 2 måneder. Denne teknikken kan brukes ikke bare for cellen transplantasjon, men også for levering av små molekyler eller gen-terapi.
Introduction
Human netthinnen ligger på baksiden av øyet funksjonene som en lys sensoriske vev og spiller en avgjørende rolle i visjon oppfatning. Netthinnen celle dysfunksjon eller celledød derfor forårsaker synsproblemer eller permanent blindhet. Lidelser som involverer degenerasjon eller dysfunksjon av celler i forskjellige lag av netthinnen som kalles degenerative retinal sykdommer, blant annet AMD er den vanligste typen og den ledende årsaken til irreversible blindhet hos eldre i utviklet land 1,2. Patologiske prosessen med AMD er forbundet med "drusen" akkumulering mellom RPE laget og underliggende Bruchs membran, som i sin tur svekker RPE støtte fra photoreceptor fysiologi, fører til nevrale Netthinne atrofi og visjonen tap3, 4,5. Så langt det er ingen kur for avanserte tørke (ikke neovascular) AMD. Fremveksten av stilk cellen terapi som et nytt paradigme i regenerativ medisin bringer håp om å erstatte dysfunksjonelle eller døde RPE cellene med Stamcelle-avledet friske celler. Faktisk omfattende prekliniske studier av transplanting stilk celler (f.eks, menneskelige embryonale stamcelleforskningen)-avledede RPE cellene i RPE-degenerative dyremodeller har vært utført6,7, hvorav noen har kommet til kliniske studier8,9 (NCT01344993, ClinicalTrials.gov). Nylig en alternativ kilde til stamceller bosatt i menneskelig RPE laget, menneskelige RPE stamceller (hRPESCs), ble identifisert av vår lab og brukes i preklinisk studier av hRPESC avledet-RPE (hRPESC-RPE)-cellen transplantasjon behandling for AMD 10 , 11 , 12 , 13.
Subretinal injeksjon teknikken brukes i preklinisk studiene nevnt av flere grupper, inkludert vår gruppe. Det er to generelle tilnærminger til subretinal injeksjon i dyr: trans-vitreal og trans-Innbukking. Trans-vitreal tilnærming har fordelen av kirurgen kunne direkte observere p enden som trenger fremre øyet, krysser hele vitreal hulrom tilstøtende linsen, og trenger netthinnen på baksiden for øyet å nå subretinal plass14,15,16. Det krever imidlertid forstyrre netthinnen på to steder (fremre og bakre), bærer risikoen for skade linsen, og kan medføre tilbakestrømming av celler i linsen når nålen er trukket. I kontrast, trans-sclera tilnærming, i prinsippet, unngår involvering av netthinnen og linsen, og tilbakestrømming avslutter øyet. I pigmentert gnagere, kirurgen kan først observere penetrasjon av sclera, men etter passering i pigmentert akkord, p enden er ikke lenger synlig. Uten direkte observasjon, brudd på netthinnen er vanlig og kan resultere i netthinnen disseksjon og leveringen av celler og/eller blod inn i linsen. Videre, fordi øyet overflaten er buet, er det svært vanskelig å vite hvilke nål vinkler og dybder er mest effektive for trans-Innbukking injeksjoner.
I denne visualisert artikkelen introduserer vi en trans-Innbukking subretinal injeksjon metode informert ved bruk av post-kirurgiske evalueringer med Optical Coherence tomografi (OCT), som gir en detaljert undersøkelse av injeksjonsstedet. Våre trans-Innbukking injeksjon teknikken bruker definerte steder, vinkler og dybder for injeksjon nåler til å produsere svært lav kirurgisk traumer og høy pålitelighet. Her viser vi spesielt injeksjon av hRPESC-RPE celler i subretinal plass av RCS rotte, en pre-klinisk modell av menneskelig AMD. Med denne injeksjon metoden levert vi vellykket og konsekvent hRPESC-RPE celler i subretinal løpet av RCS rotte øynene med en meget høy suksessrate. Injeksjon av celler ble tidligere funnet for å resultere i bevaring av RCS fotoreseptorer 2 måneder etter injeksjon13. Denne prosedyren utføres under dissecting mikroskopet og er lett å lære. Det krever to personer (en kirurg og en assistent) for å utføre injeksjon og Gjennomsnittstiden av injeksjon for hvert dyr er mindre enn 5 minutter. Den definerte vinkler og dybder for injeksjon nåler gjør det mulig for laboratorier, hvor OCT er utilgjengelig, å oppnå vellykket subretinal injeksjon. Det gir svært reproduserbar subretinal tilgang og kan brukes ikke bare for cellen transplantasjon, men også stoffet levering og gene terapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer som involverer dyr har blitt godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) til State University of New York på Albany.
1. pre-injeksjon forberedelse
-
Utarbeidelse av en hRPESC-RPE celle suspensjon
Merk: Alle følgende trinn er utført i sterilt vev kultur hette og kjennskap til grunnleggende steril teknikk er nødvendig.- Isolere primære hRPE celler fra menneskelige donor øyne alderen 50-90 år og kultur celler i 24-vel plater12. Cryopreserve cellene på passering 1, tine behov og kultur passasje 2 (P2) celler for 4-5 uker (figur 1A) for injeksjon.
- Fjerne de kultur medium12 og forsiktig rense brønner to ganger med 500 µL pre varmet 1 X Dulbeccos fosfat bufret Saline uten kalsium og Magnesium (1 x DPBS-CMF) ved å legge til 1 X DPBS-CMF i brønner bruker en 1000 µL pipette og fjerner den med et vakuum.
- Legge til 300 µL trypsin/DNAse i hver brønn. Inkuber hRPESC-RPE celler i trypsin/DNAse (4 kU DNase per 1 mL av 0,25% trypsin-EDTA) i 4 min på 37 ° C til å distansere cellene.
- Merk cellene under mikroskop for å se om de har rundet opp. Fortsette å ruge cellene i trypsin/DNase for en ekstra 2 min hvis de ikke har rundet opp ennå.
- Når cellene er rundet opp, kan du bruke en 1000 µL pipette triturate frittliggende cellene fra brønnen og overføre trypsin/DNase som inneholder frittstående celler i en 15-mL konisk rør med lik antall forvarmes kultur medium, å deaktivere trypsin/DNase.
- Skyll brønner med forvarmes 1 X DPBS-CMF av pipettering forsiktig opp og ned, spesielt rundt kantene av brønnen; deretter legge til disse cellene tidligere konisk røret.
- Sentrifuge konisk røret 286 x g i 5 min på 4 ° C pellets cellene.
- Fjern nedbryting og resuspend cellene med 1 mL kultur medium.
- Telle celler ved hjelp av en hemocytometer.
- Sentrifuge 286 x g i 5 min på 4 ° C pellets cellene.
- Fjern nedbryting og resuspend celler i sterilt balansert Salt løsning (BSS) på 50.000 celler/µL (for å levere 50000 celler i 1 µL volum under subretinal injeksjon).
- Overføre siste celle suspensjon (CS) til en 1.7-mL microcentrifuge rør og holde en isvann blanding til injeksjon bruk.
-
Utarbeidelse av cellen injektor
- Sett inn en bakteriefri 33-gauge skrå nål i injeksjon sprøyten og skru tett å montere injektoren.
- Tømme injektoren med 100% etanol 5 - 6 ganger.
- Tømme injektoren med 70% etanol 5 - 6 ganger.
- Tømme injektoren med BSS 5 - 6 ganger.
- Merke injektor nålen med en bakteriefri svart markør pennen på en posisjon på 600 µm fra spissen av nålen under dissecting mikroskopet (figur 1B).
- Plass injektoren på en micromanipulator for injeksjon.
2. subretinal injeksjon
-
Kirurgiske området og dyr forberedelse
- Veie rotte for 4-5 uke gamle RCS (60-100 g) og bedøve det bruker isoflurane damp leveringssystem.
Merk: Å indusere anestesi holde isoflurane flow rate på 5%. Bekreft dybden av anestesi ved å trykke paws, og deretter redusere infusjonshastigheten 2-3% for anestesi vedlikehold under operasjonen. - Plass en steril kirurgi drapere, med en varmeputen under, på scenen av dissecting mikroskop for å sette opp et sterilt kirurgiske området.
- Overføre rotta til det kirurgiske området og plasser rotta i en forpart koblet til isoflurane for å opprettholde anestesi.
- Dekk rottenes kropp med gasbind. Knip rottas tå for å bekrefte full narkose.
- Veie rotte for 4-5 uke gamle RCS (60-100 g) og bedøve det bruker isoflurane damp leveringssystem.
-
Trans-Innbukking subretinal injeksjon under mikroskopet
- Påfør en dråpe øye smøremiddel på rat's unoperated eye.
- Plasser rotta på høyre side med sin venstre øye mot taket for injeksjon, hodet mot kirurgens høyre hånd og ryggen mot kirurgen.
- Trimme noen værhår som dekker øyet med liten saks.
- Drypp litt øye vask fra timelige side av venstre øye og samle overflødig på nese side med en bomull applikator skylle øyet.
- Dilate elevene med 1% tropicamide og 2,5% phenylephrine (ferske fra 10% phenylephrine fortynne den i sterilt saltvann 0,9% på dagen) for en post injeksjon OCT eksamen ved å bruke en dråpe hver.
- Trekk forsiktig huden rundt øynene 4 - 6 ganger åpne øyelokket slik at øyet er litt proptosed for enklere tilgang til områder bakenfor limbus.
- Påfør en dråpe øye vask og holde øyet fuktig.
- Forsiktig triturate CS (forberedt i trinn 1.1.12) og laste injektoren med 1,2 µL CS. Den ekstra 0,2 µL brukes til å kompensere for injeksjon tilbakestrømming.
Merk: Basert på våre målinger, om 5,000-8,000 celler er tapt i tilbakestrømming med en injeksjon av 50 000 celler/µL som tilsvarer ca 10-16% av cellen tap og en ekstra 0,2 µL cs ble injisert for å kompensere dette tapet av cellen. - Plasser injektoren fylt med CS på en micromanipulator (eller ha en assistenten avholde den) vertikalt som RPE celler har tendens til synke lett i suspensjon.
- Påfør en dråpe 0,5% proparacaine (lokale aktuell bedøvelse) på øyet og fjerne overflødig med en bomull applikator.
Merk: Dette trinnet bør undertrykke det hornhinnen refleks og hindre øyet blinker under senere trinn. - Bruk tang til grep Konjunktiva bakenfor limbus, rotere øyet nasally og løfte Konjunktiva for å gjøre et "telt".
- Bruk saks til å klippe toppen av "teltet" av å gjøre en liten åpning i Konjunktiva og utsette underliggende sclera.
- Bruk tang grep kanten av gjenværende bindehinnen margen ved siden av limbus og rotere øyet nasally slik at pupillary aksen er i en vinkel på ca 30 grader i forhold til bordplaten (figur 1 c). Fortsatt gripende på bindehinnen margene er nødvendig å gi en mot styrke under nål innsettinger og opprettholde øyet på en optimal vinkel.
- For å gjøre pilothull for celle injeksjon, plasser slutten av en steril skrå 31-gauge insulin nål på 1200-1500 µm bakenfor limbus med åpningen av spissen grossist.
- Justere vinkelen på insulin nålen slik at det er 10-15 grader over sclera (tangential til en imaginær flyet på tiltenkte injeksjonsstedet). Sakte trenge sclera-akkord komplekset til en nål dybde på om lag 500 µm. I pigmentert rotte forsvinne p enden"" under pigmentert akkord. For merket av insulin nål brukes her, er avstanden fra pinne-spissen til skråkant 500 µm.
- Forsiktig ta insulin nålen (en svært liten effusjon blod kan bli sett).
- Hvis overdreven blødning er angitt, brukes en øye spyd Fjern hullet, om nødvendig. Fortsatt blødning etter spyd programmet angir et fartøy kan ha blitt skadet.
- Guide RPE celle-lastet injektor nålen i piloten hullet, med åpningen vendt ned, og i en vinkel på ca 10-15 grader i forhold til lokale overflaten av sclera.
- Forsiktig inn injektor nålen pilothull til en dybde på ca 500 µm tilgang til subretinal plassen. Det bør være om en 100 µm margin mellom kanten av svart penn merket og punktet der nålen er dekket av den pigmentert akkord (figur 1 c og 1 D).
- Spør hjelperen å forsiktig trykke ned stempelet til sprøyten injektor å injisere den aktuelle mengden celler (ca 1,2 µL). Være klar til å gi noen Counter kraft som hjelperen trykker på stempelet.
Merk: Tidligere narr praksis med hjelperen kan gi både kirurg og assistent med den nødvendige erfaringen med dette trinnet. - Mens visuelt fokus på pennen merke kanten, holde injektoren i stedet for 25-30 s og så sakte trekke injektoren. En liten mengde tilbakestrømming er vanligvis observert.
Merk: Hvis ingen tilbakestrømming er observert, kan det ha vært en intravitreal injeksjon. Hvis du ser tilbakestrømming gjennom segl eller celler fylle under sclera, var injeksjon for grunt. - Skyll celle middelklasseinnbyggere fra injeksjonsstedet med sterile øye vask 3 ganger og samle overflødig med en bomull applikator.
- Påfør en dråpe øye smøremiddel på styres øyet og overføre rotta til OCT-stasjonen for å undersøke hvor transplantert celler og størrelsen på den subretinal bleb.
3. etter injeksjon behandling
-
Anti-inflammatorisk og smerte reliever behandling
- Injisere buprenorfin på 0,1 mg/kg kroppsvekt i saltvann subcutaneously å redusere smerte.
- Injisere deksametason på 1,6 mg/kg kroppsvekt i saltvann ved intraperitoneal injeksjon (IP) for betennelse kontroll.
-
Dyr utvinning
- Tilbake rotta til utvinning byrået under en varmelampe å opprettholde kroppstemperatur.
- Observere styres øye for tegn til blødning.
- Observere rotta å sikre det kommer ut av anestesi.
- Returnere den gjenopprettede dyr å en frisk bur flagg buret med kirurgi kort og overvåke daglig for tegn på distress, okulær blødning eller hornhinnen tetthet. Varsle veterinær umiddelbart hvis det er bekymringer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Bruker teknikken er beskrevet i denne artikkelen, levert vi konsekvent hRPESC-RPE celler i subretinal plass av RCS rotter ved å kontrollere nøyaktig plassering, vinkel og dybde på injektor nål innsetting i vev (figur 1B-D ). Umiddelbart følgende transplantasjon, OCT eksamen ble utført for å observere injeksjonsstedet og den subretinal bleb opprettet av transplantert cellene. Post-kirurgiske OCT evaluering fungerer som en screening verktøyet for å vurdere kvaliteten på injeksjoner og overvåking for retinal skade eller blødning. Begge de subretinal bleb (figur 2A, C og D) og injeksjonsstedet (figur 2A og B) kan sees tydelig under Tilpasningsverktøy skanning. Den subretinal bleb løser vanligvis i 24 timer etter injeksjonen. Selv om måling av størrelsen på blebs er vanskelig å bruke OCT, kan vi beregne området bleb antar det er lik photoreceptor bevaring arealet av cellen transplantasjon. Vi viste tidligere at en 1 µL injeksjon av 50 000 celler kan føre sparer ca 6-7% området av netthinnen som RCS rundt injeksjon området13. Som vist i figur 2A, C og D, retinal lag var intakt på injeksjonsstedet, ingen blod ble oppdaget i bleb, og ingen celler ble observert i linsen, demonstrere minimal traumer forårsaket av injeksjon. I tillegg ble representant OCT bilder av mislykkede injeksjoner også inkludert for referanse (figur 2E og F).
Med bruk av OCT som tilbakemelding verktøy optimalisert vi vinkel og dybde av injektor nåleinnføring i vev. Når optimalisert, mislykkes denne metoden tillatt oss å oppnå en suksessrate på 90.8% subretinal tilgang med bare 5,7% kirurgiske, basert på resultatene av mer enn 300 forrige subretinal injeksjoner i våre andre studier13 (tabell 1). I de resterende 3,5%, ble OCTs ikke utført av flere grunner, inkludert øyne ikke i tilstrekkelig stilling på grunn av isoflurane anestesi-assosiert øyet rullende17.
På 7 dager etter transplantasjon, var styres rotte øynene enucleated, fast og inndelte for immunohistological analyse. En human celle kjernefysiske markør (Hunu)18 og en RPE celle markør (OTX2)19 ble brukt til å oppdage transplantert cellene. Figur 3 viste et tykt lag av transplantert RPE celler i feltet subretinal det, en uke etter injeksjon, var positivt beiset med begge merkene, bekrefter identiteten og vellykket levering av transplantasjoner. På en uke etter injeksjon, kan det store antallet celler, som vist i Figur 3 c, raskt synke til et lite antall på grunn av verten immunrespons i svekket immunapparat RCS rotter20. Som nevnt ovenfor, kan likevel degenerert photoreceptor laget av RCS rotte øyne finnes å bli reddet i minst 2 måneder etter transplantasjon med hRPESC-RPE13.
Figur 1 : Et bilde av 4 - uke gamle P2 hRPESC-RPE celler og en demonstrasjon av vinkel og dybde som injektor nålen bruker under injeksjon. (A) en kontrast bilde av 4 - uke gamle P2 hRPESC-RPE celler brukes til injeksjon. Skala bar = 100 µm. (B) en skjematisk viser 600 µm avstanden mellom kanten av markøren og spissen av injektor nålen målt ved en Mikroskala. Minimum eksamen av Mikroskala er 100 µm. (C) en karikaturtegning som viser tverrsnitt av anatomiske strukturen av en rotte øye og en sideutsikt over vinkel og dybde som injektor nålen setter inn i øyet veggen. Pupillary aksen av rotte øyet er 30 grader i forhold til bordplaten injektor nålen er 15 grader i forhold til lokale overflaten av øyeeplet. (D) en karikaturtegning som viser startpunktet for markøren på injektor nålen og øvre del av injeksjonsstedet der 500 µm injektor nålen settes inn i vevet og 100 µm plass igjen mellom åpningen av injeksjon hullet og kanten av marke r. plasseringen av hullet er 1200-1500 µm bakenfor limbus. Pinne-spissen vises på siden, men bør være ned under injeksjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : OCT bilder av styres rotte øyet umiddelbart etter injeksjon. (A) en OCT B-scan bilde av øye styres viser et subretinal bleb og injeksjon området, uten intravitreal blødning. (B) et OCT volum intensitet projeksjon (VIP) bilde av en B-scan serie som representerer enface fundus bildet av området injisert. Liten injeksjonsstedet vises i VIP bildet viser minimal traumer. (C) en forstørret OCT bilde av (A) viser transplantert cellene inn subretinal med alle retinal lag merket. Dette bildet vist at transplantert cellene var plassert i subretinal rommet. (D) en OCT B-scan bilde viser en gjennomsnittlig størrelse subretinal bleb. (E) et OCT B-scan bilde viser en mislykket subretinal injeksjon med CS i feltet intravitreal. (F) en OCT B-scan bilde viser en mislykket subretinal injeksjon med hele netthinnen poking gjennom på injeksjonsstedet. Skalere barer = 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Immunohistological farging av retinal frosne deler etter transplantasjon av hRPESC-RPE celler. (A) human celle kjernefysiske markør (Hunu) flekker som angir påvisning av transplantert menneskelige RPE celler. (B, E) Celle kjernefysiske counter flekker (4', 6-diamidino-2-phenylindole; DAPI) viser retinal lagene, transplantasjon og RPE lag. (C) en sammenslåtte bildet av Hunu og DAPI som indikerer at transplantert hRPE cellene er plassert i subretinal rommet. Avstanden mellom transplantasjon og RPE lag er en behandling gjenstand tilknyttet cryo-beskytte RCS øyne for frosne snitt. (D) RPE celle markør (OTX2) flekker av transplantert menneskelige RPE celler. (F) en sammenslåtte bildet av OTX2 og DAPI. Skala bar = 20µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Totalt injisert RCS rotte øyne | God subretinal blebs under OCT | Små subretinal blebs under OCT | Totalt ikke-komplisert subretinal blebs under OCT | Complicatd subretinal blebs under OCT (i.e. luftboble i den eller retinal blødning) | Ingen OCT utført | Kirurgisk mislykkes (ingen subretinal bleb under OCT) | |
| Antall | 314 | 260 | 25 | 285 | 5 | 6 | 18 |
| % av totale injisert øyne | ------ | 82.80% | 7,96% | 90.76% | 1,59% | 1.91% | 5.73% |
| (Disse dataene oppsummeres fra ti kohorter av subretinal injeksjoner i RCS rotter) | |||||||
Tabell 1: En oppsummering av subretinal injeksjoner fra ti eksperimentelle kohorter i RCS rotter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Subretinal injeksjon teknikken beskrevet i denne artikkelen er via trans-Innbukking veien, der injektor nålen trenger det ytterste lag (sclera-akkord-RPE komplekset) av øyet veggen uten skade neural netthinnen eller forstyrrer glasslegemet hulrom. En alternativ trans-vitreal tilnærming har en potensiell risiko linsen skade fører til katarakt, siden gnagere linsen opptar mesteparten av glasslegemet hulrom. Sammenlignet med denne metoden, våre teknikken er mindre risikabelt og forårsaker minimal traumer som injektor nålen ikke trenger å gå over hele glasslegemet hulrommet å nå subretinal plassen. Faktisk OCT eksamen i våre studier viste sjelden retinal penetrasjon hendelser, og oppfølging eksamen i dyr, det er ingen vedvarende retinal detachments. I tillegg injeksjonsstedet er svært liten (< 200 µm i diameter) når bruker en 33-gauge injektor p så strukturelle forstyrrelse av sclera-akkord-RPE komplekset er svært begrenset. Etter re-nål injeksjon hullet selv forsegler automatisk så ingen maske eller vev limet er nødvendig.
Komplikasjoner med kirurgi inkluderer overdreven blødning rundt injeksjonsstedet området eller fra pilot hullet. Når du bruker tang til grep bindehinnen margin på limbus, er bare mild makt nødvendig for å unngå knipe blodkar og redusere mulig blødning. Før du oppretter pilothull, undersøke tiltenkte injeksjonsstedet for å unngå penetrasjon av sprengte blodkar. Ved hjelp av et spyd, kan pilot hullet fjernes av blod før innsetting av celle injeksjon nålen. Hvis blødning fra pilot hullet vedvarer etter noen programmer av spydet, er et fartøy brutt. En annen complication observerte vi er en liten prosentandel av RCS rotter utvikle hornhinnen tetthet post-operatively. I noen tilfeller tetthetsverdiene forblir uendret kronisk og andre var forbigående. Dyr med vedvarende tetthet ble fjernet fra studiegruppen. Hornhinnen tetthet kan utvikle på grunn av øye tørrhet, fysisk skade, betennelse, narkotika eller øyets21. For å redusere deres dannelse, øyet bør holdes fuktig ved å opprettholde god øye smøring, og unngå å berøre hornhinnen med en bomull applikator eller andre verktøy under operasjonen.
Injeksjon protokollen skissert her bruker definerte tilnærming vinkler og nål dybder i forhold til okulær landemerker, og øynene vinkler i forhold til tabellen kirurgisk i vår organisering. Bruk etter injeksjon OCT skanninger var viktig i raffinering parameterne injeksjon for å gi reproduserbar kontroll over RPE cellen transplantasjon til rottene subretinal plass med høy nøyaktighet. Når mestret av gjentatte praksis, er metoden enkelt å utføre. Det anbefales, spesielt i trening, at post-kirurgiske okulær eksamener er utført for å avgjøre utfallet. Vinkel og dybde av injeksjon p vil trolig må justeres tilsvarende til denne tilbakemeldingen avhengig av kirurgiske oppsettet, alder av dyr, og/eller hvis andre dyrearter brukes (f.eks, musen).
Å vurdere injeksjon kvaliteten og bestemme inkludering eller utelukkelse fra en studie, er tilstedeværelse av subretinal blødde fra OCT observasjon avgjørende. I laboratorier, hvor OCT er utilgjengelig, vilkårene beskrevet nedenfor kan brukes til en rask screening av kirurger for å utelukke mistanke om injeksjon mislykkes: (1) før injeksjon: (a) Pilot hull er laget for dypt (dvs, betydelig dybden > 500 µm; for den merke insulin nål brukt her, avstanden fra pinne-spissen til midten av skråkant er 500 µm). (b) pilothull blør overdrevet (dvs, blødning kan ikke stoppes ved å anvende makt på hullet med øyet spears). (c) injeksjon nålen går for dypt (dvs., betydelig dybden > 500 µm eller markøren injeksjon nålen går inn sclera/akkord/RPE komplekse vev). (2) under injeksjon: (a) kunne opprettholde injeksjon nålen i piloten hullet under injeksjon. (b) lekkasje umiddelbart rundt injeksjon nålen under injeksjon. (c) injeksjon nålen presset for dypt (i.e.markøren injeksjon nålen går inn sclera/akkord/RPE komplekse vev) idet bemerket kirurgen under injeksjon. (d) kan ikke opprettholde injeksjon nålen i stillingen i mer enn 5 sekunder etter injeksjon. (e) overdreven blod når trekke injeksjon nålen. (f) ingen tilbakestrømming/middelklasseinnbyggere sett etter tilbakekalling av injeksjon nålen kombinert med trinn 2.
Tatt sammen med forsiktig håndtering av nålen plasseringen, vinkler og dybder, trans-Innbukking subretinal injeksjon teknikken er svært pålitelig, nøyaktig, og kan bære minimal kirurgisk traumer. Med alle disse fordelene, kan denne teknikken brukes ikke bare for levering av RPE celler, men også for andre celletyper, forbindelser eller gen-terapi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Vi ønsker å takke Patty Lederman for henne hjelp på kirurgi og Susan Borden for RPE celle forberedelse. Vi erkjenner også NYSTEM C028504 for finansiering for dette prosjektet. Justine D. Miller støttes av NIH gi F32EY025931.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25200-072 | |
| DNAse I | Sigma | DN-25 | |
| 1xDulbecco’s Phosphate Buffered Saline without Calcium & Magnesium (1xDPBS-CMF) | Corning Cellgro | 431219 | |
| Sterile Balanced Salt Solution (BSS) | Alcon | 00065079550 | |
| Sterile eye wash | Moore Medical | 75519 | |
| Sterile 0.9% saline | Hospira | 488810 | |
| Proparacaine Hydrochloride Ophthalmic Solution (0.5%) | Akorn | 17478026312 | |
| Tropicamide Ophthalmic Solution, USP (1%) | Bausch & Lomb | 24208058559 | |
| Phenylepherine Ophtalmic Solution, USP (10%) stock | Bausch & Lomb | 42702010305 | This is used to make 2.5% Phenylepherine |
| Buprenex | Patterson | 433502 | |
| Dexamethasone | APP Pharmaceuticals | 63323051610 | |
| 100% Ethanol | Thermo Scientific | 615090040 | |
| 70% Ethanol | Ricca Chemical Company | 2546.70-5 | |
| Sterile GenTeal Lubricant Eye Gel | Novartis | 78042947 | |
| Sterile Systane Ultra Lubricant Eye Drops | Alcon | 00065143105 | |
| hRPESC-RPE cells | Not available commercially | Please refer to "Reference #12" for cell isolation and mainteinance. | |
| 24-well plates | Corning | 3526 | |
| Conical tubes (15 ml) | Sarstedt | 62554002 | |
| Microcentrifuge cap with o-ring | LPS inc | L233126 | |
| Capless Microcentrifuge tubes (1.7 ml) | LPS inc | L233041 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5804R | |
| Sterile alcohol wipe | McKesson | 58-204 | |
| Sterile cotton tip applicators | McKesson | 24-106-2S | |
| Sterile Weck-Cel spears | Beaver-Visitec International | 0008680 | |
| Sterile surgical drapes | McKesson | 25-515 | |
| Gauze | McKesson | 16-4242 | |
| Nanofil syringe (10 ul) | World Precision Instruments | Nanofil | |
| Nanofil beveled 33-gauge needle | World Precision Instruments | NF33BV-2 | |
| Insulin syringe needles 31-gauge | Becton Dickinson | 328418 | |
| Rat toothed forceps | World Precision Instruments | 555041FT | |
| Vannas Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5602 | |
| Circulating water T pump | Stryker | TP700 | |
| Heating pad | Kent Scientific | TPZ-814 | |
| Animal anesthesia system | World Precision Instruments | EZ-7000 | |
| Balance | Ohaus | PA1502 | |
| Stereo microscope | Zeiss | Stemi 2000 | |
| Microscope light source | Schott | ACE series | |
| Bioptigen Envisu Spectral Domain Ophthalmic Imaging System | Bioptigen | R2210 | |
| Sterile black marker pen | Viscot Industries | 1416S-100 | |
| Miniature measuring scale | Ted Pella Inc | 13623 | |
| Infrared Basking Spot Lamp | EXO-TERRA | PT2144 | This is used as a heating lamp for animals during the post-surgical recovery phase |
References
- De Jong, P. T.
- Wong, W. L., et al. Global prevalence of age-related macular degeneration and disease burden projection for 2020 and 2040: a systematic review and meta-analysis. Lancet Global Health. 2 (2), e106-e116 (2014).
- Ambati, J., Fowler, B. J. Mechanisms of agerelated macular degeneration. Neuron. 75, 26-39 (2012).
- Abdelsalam, A., Del Priore, L. V., Zarbin, M. A. Drusen in age-related macular degeneration: Pathogenesis, natural course, and laser photocoagulation-induced regression. Surv Ophthalmol. 44 (1), 1-29 (1999).
- Jager, R. D., Mieler, W. F., Miller, J. W.
- Lund, R. D., et al. Human embryonic stem cell-derived cells rescue visual function in dystrophic RCS rats. Cloning Stem Cells. 8 (3), 189-199 (2006).
- Vugler, A., et al. Embryonic stem cells and retinal repair. Mech Dev. 124 (11-12), 807-829 (2007).
- Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379 (9817), 713-720 (2012).
- Schwartz, S. D., et al. Human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium in patients with age-related macular degeneration and Stargardt's macular dystrophy: follow-up of two open-label phase 1/2 studies. Lancet. 385 (9967), 509-516 (2015).
- Stanzel, B. V., et al. Human RPE Stem Cells Grown into Polarized RPE Monolayers on a Polyester Matrix Are Maintained after Grafting into Rabbit Subretinal Space. Stem Cell Reports. 2 (1), 64-77 (2014).
- Blenkinsop, T. A., et al. Human adult retinal pigment epithelial stem cell-derived RPE monolayers exhibit key physiological characteristics of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (12), 7085-7099 (2015).
- Salero, E., et al. Adult human RPE can be activated into a multipotent stem cell that produces mesenchymal derivatives. Cell Stem Cell. 10 (1), 88-95 (2012).
- Davis, J. R., et al. Human RPE Stem Cell-Derived RPE Preserves Photoreceptors in the Royal College of Surgeons Rat: Method for Quantifying the Area of Photoreceptor Sparing. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 32 (5), 304-309 (2016).
- Westenskow, P. D., et al. Performing Subretinal Injections in Rodents to Deliver Retinal Pigment Epithelium Cells in Suspension. J Vis Exp. (95), e52247 (2015).
- Lopez, R., et al. Transplanted Retinal Pigment Epithelium Modifies the Retinal Degeneration in the RCS Rat. Invest Ophthalmol Vis Sci. 30 (3), 586-588 (1989).
- Eberle, D., Santos-Ferreira, T., Grahl, S., Ader, M. Subretinal Transplantation of MACS Purified Photoreceptor Precursor Cells into the Adult Mouse Retina. J Vis Exp. (84), e50932 (2014).
- Nair, G., et al. Effects of Common Anesthetics on Eye Movement and Electroretinogram. Doc Ophthalmol. 122 (3), 163-176 (2011).
- McGill, T. J., et al. Transplantation of human central nervous system stem cells - neuroprotection in retinal degeneration. Eur J Neurosci. 35, 468-477 (2012).
- Al-Hussaini, H., Kam, J. H., Vugler, A., Semo, M., Jeffery, G. Mature retinal pigment epithelium cells are retained in the cell cycle and proliferate in vivo. Mol Vis. 14, 1784-1791 (2008).
- Wang, S., Lu, B., Wood, P., Lund, R. D. Grafting of ARPE-19 and Schwann Cells to the Subretinal Space in RCS Rats. Invest Ophthalmol Vis Sci. 46 (7), 2552-2560 (2005).
- Fabian, R. J., Bond, J. M., Drobeck, H. P.
