3 डी चुंबकीय स्टेम सेल एकत्रीकरण और बायोरिएक्टर परिपक्वता उपास्थि उत्थान के लिए
Summary
स्टेम सेल से उपास्थिजनन संस्कृति की स्थिति ठीक ट्यूनिंग की आवश्यकता है। यहाँ, हम कोशिकाओं संघनक के लिए एक चुंबकीय दृष्टिकोण प्रस्तुत करते हैं, एक आवश्यक कदम उपास्थिजनन आरंभ करने के लिए। इसके अलावा, हम बताते हैं कि एक बायोरिएक्टर में गतिशील परिपक्वता सेलुलर निर्माणों को यांत्रिक उत्तेजना लागू होता है और उपास्थि बाह्य मैट्रिक्स उत्पादन को बढ़ाता है।
Abstract
उपास्थि इंजीनियरिंग एक इन विट्रो कार्यात्मक देशी ऊतक के समान प्रत्यारोपण बनाने में कठिनाइयों की वजह से एक चुनौती बनी हुई है। एक दृष्टिकोण है हाल ही में ऑटोलॉगस प्रतिस्थापन के विकास के लिए पता लगाया chondrocytes में स्टेम कोशिकाओं के भेदभाव शामिल है। इस उपास्थिजनन, स्टेम सेल के लिए आवश्यक है की संघनन की एक डिग्री शुरू करने के लिए; इसलिए, हम चुंबकीय संघनक कोशिकाओं की व्यवहार्यता का प्रदर्शन किया, दोनों मोटी scaffolds और पाड़ मुक्त भीतर, सेल अट्रैक्टर के रूप में छोटी चुंबकीय क्षेत्र स्रोतों का उपयोग। यह चुंबकीय दृष्टिकोण भी कुल संलयन मार्गदर्शन और पाड़ मुक्त, संगठित का निर्माण करने के लिए इस्तेमाल किया गया था, तीन आयामी (3 डी) आकार में कई मिलीमीटर ऊतकों। एक उन्नत आकार होने के अलावा, ऊतक चुंबकीय चालित संलयन द्वारा गठित कोलेजन द्वितीय की अभिव्यक्ति में एक उल्लेखनीय वृद्धि प्रस्तुत किया, और एक समान प्रवृत्ति aggrecan अभिव्यक्ति के लिए मनाया गया। के रूप में देशी उपास्थि बलों टी कराया गया थाटोपी अपने 3 डी संरचना को प्रभावित किया, गतिशील परिपक्वता भी प्रदर्शन किया था। एक बायोरिएक्टर कि यांत्रिक उत्तेजनाओं प्रदान करता है एक 21 दिन की अवधि में चुंबकीय वरीयता प्राप्त scaffolds संस्कृति के लिए इस्तेमाल किया गया था। बायोरिएक्टर परिपक्वता काफी हद तक cellularized scaffolds में उपास्थिजनन सुधार; बाह्य मैट्रिक्स इन परिस्थितियों में प्राप्त कोलेजन द्वितीय और aggrecan में समृद्ध था। इस काम अभिनव सुधार chondrogenic भेदभाव, दोनों पाड़ मुक्त और भीतर polysaccharide scaffolds के लिए एक बायोरिएक्टर में लेबल स्टेम कोशिकाओं के चुंबकीय संक्षेपण और गतिशील परिपक्वता की क्षमता की रूपरेखा।
Introduction
चुंबकीय नैनोकणों पहले से ही चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) के लिए इसके विपरीत एजेंट के रूप में क्लिनिक में किया जाता है, और उनके चिकित्सीय अनुप्रयोगों के विस्तार रखने के लिए। उदाहरण के लिए, यह हाल ही में दिखाया गया है कि लेबल कोशिकाओं आरोपण 1, 2, 3 के एक परिभाषित स्थल पर / एक बाह्य चुंबकीय क्षेत्र का उपयोग कर विवो में हेरफेर किया जा सकता है और निर्देश दिया जा सकता है और या बनाए रखा। पुनर्योजी चिकित्सा में, वे इन विट्रो 4 में आयोजित ऊतकों, संवहनी ऊतक 5, 6, 7, हड्डी 8, और उपास्थि 9 सहित इंजीनियर के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
संधि उपास्थि एक avascular वातावरण में डूब जाता है, बाह्य मैट्रिक्स घटकों की मरम्मत बहुत सीमित कर रही है जब नुकसान होते हैं। इस कारण से, शोध के लिएज वर्तमान में पारदर्शी उपास्थि प्रतिस्थापन कि दोष स्थल पर प्रत्यारोपित किया जा सकता है की इंजीनियरिंग पर केंद्रित है। आदेश में एक ऑटोलॉगस प्रतिस्थापन का उत्पादन करने में, कुछ अनुसंधान समूहों, एक सेल स्रोत 10, 11 के रूप में ऑटोलॉगस chondrocytes के उपयोग को तलाश रहे हैं, जबकि दूसरों मीजेनकाइमल स्टेम कोशिका (एमएससी) की क्षमता chondrocytes 12, 13 में अंतर करने के लिए जोर देते हैं। पिछले अध्ययनों यहाँ recapitulated में, हम, एमएससी चयनित उनके अस्थि मज्जा नमूना के रूप में काफी सरल है और स्वस्थ chondrocytes, जो उनके phenotype 14 खोने का जोखिम के बलिदान की आवश्यकता नहीं है।
एक प्रारंभिक कदम स्टेम सेल के chondrogenic भेदभाव की शुरुआत करने के लिए आवश्यक उनके संघनन है। सेल समुच्चय आमतौर पर या तो centrifugation या Micromass संस्कृति 15 का उपयोग कर का गठन कर रहे हैं; हालांकि, ये संक्षेपण तरीकों neitheआर मोटी scaffolds और न ही संभावित समुच्चय के विलय को नियंत्रित करने के भीतर कोशिका समूहों बनाने की क्षमता मौजूद है। इस पत्र में, हम एमएससी चुंबकीय लेबलिंग और चुंबकीय आकर्षण का उपयोग कर स्टेम सेल संघनक करने के लिए एक अभिनव प्रयासों का वर्णन। इस तकनीक को एक मिलीमीटर पैमाने पर उपास्थि ऊतक 9 प्राप्त करने के लिए एक दूसरे के साथ समुच्चय के विलय के माध्यम से पाड़ मुक्त 3 डी निर्माणों के रूप में साबित किया गया है। मोटी और बड़ी scaffolds के चुंबकीय बोने भी इंजीनियर ऊतक के आकार में वृद्धि, आरोपण के लिए एक आकार और अधिक आसानी से उपयोगी डिजाइनिंग, और उपास्थि की मरम्मत में नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए संभावित विविधता लाने की संभावना की अनुमति दी है। यहाँ, हम विस्तार प्राकृतिक पॉलीसैकराइड, पुलुलान, और dextran से बना झरझरा scaffolds में एमएससी के चुंबकीय बोने के लिए प्रोटोकॉल, मचान पहले से स्टेम कोशिकाओं 16, 17 को सीमित करने के लिए इस्तेमाल किया। Chondrogenic भेदभाव finall थाy scaffolds कोशिकाओं के एक उच्च घनत्व के साथ वरीयता प्राप्त की मैट्रिक्स कोर में निरंतर पोषक तत्व और गैस प्रसार सुनिश्चित करने के लिए एक बायोरिएक्टर में प्रदर्शन किया। कोशिकाओं को पोषक तत्वों, chondrogenic विकास कारकों और गैस उपलब्ध कराने के अलावा, बायोरिएक्टर यांत्रिक उत्तेजना की पेशकश की। कुल मिलाकर, चुंबकीय स्टेम सेल सीमित करने के लिए इस्तेमाल किया प्रौद्योगिकी, एक बायोरिएक्टर में गतिशील परिपक्वता के साथ संयुक्त, स्पष्ट रूप से chondrogenic भेदभाव सुधार कर सकते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
सबसे पहले, क्योंकि यहां प्रस्तुत तकनीक चुंबकीय नैनोकणों के internalization पर भरोसा करते हैं, एक महत्वपूर्ण मुद्दा नैनोकणों के परिणाम एक बार वे कोशिकाओं के भीतर स्थानीय बनाना है। ऐसा नहीं है कि लोहे के नैनोकणो?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों बायोरिएक्टर के साथ उनकी मदद के लिए QuinXell टेक्नोलॉजीज और CellD, विशेष रूप से लोथर ग्रैनमन और डोमिनिक घोजलान स्वीकार करने के लिए करना चाहते हैं। हम कैथरीन Le व्यक्तित्व है, जो हमें पुलुलान / dextran polysaccharide scaffolds के साथ प्रदान की धन्यवाद। इस काम के यूरोपीय संघ (ERC-2014-कॉग परियोजना मैटिस 648,779) द्वारा और AgenceNationalede ला Recherche (ANR), फ्रांस (MagStem परियोजना ANR -11 SVSE5) द्वारा समर्थित किया गया।
Materials
| Iron oxide (maghemite) nanoparticules ( γ-Fe2O3) | PHENIX – University Paris 6 | Made and given by C. Ménager | Mean diameter of 8.1 nm and negative surface charge |
| Polysaccharide Pullulan/Dextran scaffolds | LIOAD – University Nantes | Made and given by C. Le Visage | Prepared from a 75:25 mixture of pullulan/dextran in alkaline conditions (10M NaOH). Porosity: 185-205µm; Thickness: 7mm; Surface area: 1.8cm2. |
| TisXell Regeneration System | QuinXell Technologies | QX900-002 | Biaxial bioreactor with 500 mL culture chamber |
| Cage for scaffolds: Histosette II M492 | VWR | 720-0909 | |
| Mesenchymal Stem Cell (MSC) | Lonza | PT-2501 | Three independant batches have been used |
| MSCGM BulletKit medium | Lonza | PT-3001 | For the complete medium, add the provided BulletKit (containing serum, glutamine and antibiotics) to the MSCGM medium |
| DMEM with Glutamax I | Life Technologies | 31966-021 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| RPMI medium 1640, no Glutamine | Life Technologies | 31870-025 | No sodium pyruvate, no HEPES |
| PBS w/o CaCl2 w/o MgCl2 | Life Technologies | 14190-094 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x) | Life Technologies | 25300-054 | |
| Penicillin (10.000U/mL)/Streptomicin (10.000µg/mL) | Life Technologies | 15140-122 | |
| ITS Premix Universal Culture Supplement (20x) | Corning | 354352 | |
| Sodium pyruvate solution 100mM | Sigma | S8636 | |
| L-Ascorbic Acid 2-phosphate | Sigma | A8960 | Prepare the concentrated solution (25 mM) in distilled water extemporaneously |
| L-Proline | Sigma | P5607 | Prepare the 175 mM stock solution diluted in distilled water and store at 4°C |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Prepare the 1 mM stock solution diluted in Ethanol 100% and store at -20°C |
| TGF-beta 3 protein 10µg | Interchim | 30R-AT028 | |
| Tri-sodium citrate | VWR | 33615.268 | Prepare the 1M stock solution diluted in distilled water and store at 4°C |
| Pullulanase from Bacillus acidopullulyticus | Sigma | P2986 | |
| Dextranase from Chaetomium erraticum | Sigma | D0443 | |
| NucleoSpin RNA Extraction Kit | Macherey-Nagel | 740955.5 | |
| SuperScript II Reverse Transcriptase | Life Technologies | 18064-014 | |
| Random Primer – Hexamer | Promega | C1181 | 500 µg/mL: Use diluted 1/2 and put 1 µL per sample |
| Recombinant RNAsin ribonuclease inhibitor | Promega | N2511 | 40 U/µL: put 1 µL per sample |
| PCR nucleotide dNTP mix (10mM each) | Roche | 10842321 | |
| SyBr Green PCR Master Mix | Life Technologies | 4368708 | |
| Step One Plus Real-Time PCR System | Life Technologies | 4381792 | |
| Formalin solution 10% neutral buffered | Sigma | HT5012 | |
| OCT solution | VWR | 361603E | |
| Isopentane | Sigma | M32631 | |
| Toluidine blue O | VWR | 1.15930.0025 | |
| Ethanol absolute | VWR | 20821.310 | |
| Toluene | VWR | 1.08323.1000 | |
| Mounting medium Pertex | Histolab | 840 | |
| RPLP0 Primer for qPCR | Eurogentec | 5'-TGCATCAGTAC CCCATTCTATCAT-3' ; 5'-AAGGTGTAATC CGTCTCCACAGA-3' |
|
| Aggrecan Primer for qPCR | Eurogentec | 5'-TCTACCGCTGCGAGGTGAT-3' ; 3'-TGTAATGGAACACGATGCCTTT-5' | |
| Collagen II Primer for qPCR | Eurogentec | 5'-ACTGGATTGACCCCAACCAA-3' ; 3'-TCCATGTTGCAGAAAACCTTCA-5' |
Riferimenti
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