Here, we present a protocol for hydraulic extrusion of the spinal cord as well as identification and isolation of specific dorsal root ganglia (DRGs) in the same rodent. Compared to standard spinal cord isolation methods, this method is significantly faster and reduces the risk of tissue damage.
Traditionally, the spinal cord is isolated by laminectomy, i.e. by breaking open the spinal vertebrae one at a time. This is both time consuming and may result in damage to the spinal cord caused by the dissection process. Here, we show how the spinal cord can be extruded using hydraulic pressure. Handling time is significantly reduced to only a few minutes, likely decreasing protein damage. The low risk of damage to the spinal cord tissue improves subsequent immunohistochemical analysis. By performing hydraulic spinal cord extrusion instead of traditional laminectomy, the rodents can further be used for DRG isolation, thereby lowering the number of animals and allowing analysis across tissues from the same rodent. We demonstrate a consistent method to identify and isolate the DRGs according to their localization relative to the costae. It is, however, important to adjust this method to the particular animal used, as the number of spinal cord segments, both thoracic and lumbar, may vary according to animal type and strain. In addition, we illustrate further processing examples of the isolated tissues.
Det övergripande målet med denna metod är att isolera ryggmärgen samt att identifiera och isolera DRG 1, 2. Hydrauliska extrudering av ryggmärgen är en betydligt snabbare metod än det traditionella sättet att ryggmärgen isolering genom laminektomi, dvs genom att bryta benknotorna en i taget, och denna metod minskar risken för vävnadsskada orsakad av dissektion process 3, 4 . DRG kan vara svåra att identifiera. Korrekt identifiering är mycket viktigt för vävnadsanalys, t.ex. efter ischiasnervskada. Genom numrering av DRG enligt deras lokalisering i förhållande till costae kan DRG identifieras konsekvent.
Vävnad som isolerats genom de tekniker som visat här kan tillämpas på ett brett spektrum av analyser inklusive Western blotting 5,6, qPCR 7 och immunhistokemisk färgning 8.
När identifiera DRG, är det viktigt att ta hänsyn till att antalet ryggmärgssegment är känd för att variera med djurslag och stam 9, 10, 11. Fördelarna i att utföra denna metod i möss är det stora antalet genetiskt modifierade varianter tillgängliga och de relativt låga kostnader bostäder. Fördelarna med att använda råttor är den relativt höga vävnads avkastning och om den innebär nervskador, kommer förfarandet lindras med storlek.
Om ryggraden är störd, t ex genom cervikal dislokation, kommer ryggmärgen split under strängsprutning. Om ryggmärgen inte kan extruderas, kan ryggraden trimmas något vid båda ändar och strängsprutningsförsök kan upprepas. I fall behövs hela ryggmärgen för vidare analys, det vill säga består av hals utvidgningen samt ländryggen utvidgningen bör ryggraden bara trimmas något. Om det behövs bara ländryggen utvidgningen för vidare analys bör ryggmärgen trimmas enligt föreliggande protokoll. Ryggraden bör rätas ut med hjälp av fingertopparna för att underlätta strängsprutning.
Protokollet är tillämplig på gnagare i alla åldrar och är här exemplifierad av en vuxen mus (8 veckor), en mus pup (5 dagar) och en vuxen råtta (10 veckor). Beroende på djurslag och stam, kan antalet bröstkorg och ländryggen sektionerna varierar 9, </sup> 10, 11. Beroende på vilka proteiner som skall analyseras, vuxna gnagare kan perfusion med enzymhämmande lösningar före eutanasi. Om du utför ett experiment som involverar ensidig nervskada, kan ryggmärgen delas upp i ipsilaterala och kontralaterala sidor med ultrafina pincett omedelbart efter extrudering. Vidare kan varje sida delas upp i dorsala och ventrala sidor. Vävnaden kan sedan bearbetas för ytterligare analyser, t ex Western blotting.
Transcardial perfusion-fixering med PFA före ryggmärgen extrudering bör undvikas, eftersom detta gör att ryggmärgen icke-flexibelt och hindrar ryggmärgen hydraulisk strängsprutning. Hydrauliska ryggmärgs extrudering kommer att riva bort dorsala rötter. För experiment där fästa rygg rötter är nödvändig, är laminektomi rekommenderas. Dessutom är ryggrads hjärnhinnorna förloras genom hydraulisk strängsprutning, vilket kan undvikas genom standard laminektomi <sup class = "xref"> 3.
Hydraulisk strängsprutning av ryggmärgen och DRG isolering kan också utföras med användning syresatt artificiell cerebrospinalvätska (ACSF) i stället för iskall PBS. Användningen av ACSF medger bevarande av den isolerade vävnaden i en bättre fysiologisk miljö, vilket är särskilt viktigt i samband med efterföljande elektrofysiologiska inspelningar 12, 13. Ett alternativ till ACSF kan vara PBS innehållande 1 g / L glukos för generering av primära DRG kulturer 14.
Hydrauliska extrudering av ryggmärgen är en betydligt snabbare metod än det traditionella sättet att ryggmärgen isolering genom laminektomi, minska vävnadshanteringstiden och därmed minskar risken för proteinskada. Perfusion med ett fixativ innan isolering av ryggmärgen genom laminektomi kan minska risken för vävnadsskada vid dissekering och under slutlig avlägsning avryggmärg från ryggraden. Men utesluter vävnadsfixering dess tillämplighet analyser såsom Western blotting. Hydrauliska extrudering ger strukturellt oskadad vävnad 3 lämpar sig för ett bredare spektrum av analyser.
Konsekvent identifiering av DRG kan vara svårt. Detta är dock nödvändigt för vävnadsanalys, t.ex. efter ischiasnervskada. Genom numrering av DRG enligt deras lokalisering i förhållande till costae kan DRG identifieras konsekvent. Färgning av ryggmärg samt av DRG kan optimeras genom att utföra de illustrerade vävnadsbehandlingsvariationer som beskrivs i protokoll steg 7.
The authors have nothing to disclose.
We would like to acknowledge David Kiel, Aarhus University, for filming and editing. VirtualDub software was used for processing of microscope video sequences. We thank the Danish Research Institute of Translational Neuroscience – DANDRITE, Nordic EMBL Partnership, for access to equipment and the Aarhus University Research Foundation, EU 7FP project PAINCAGE, Det Frie Forskningsrad (DFF) and The Lundbeck Foundation for funding.
Bonn scissors, extra fine, straight, 8.5 cm | F.S.C. (Fine Science Tools) | # 14084-08 | For cutting open the spinal cord prior to isolation of DRGs (adult mouse, adult rat); Other manufacturer may be used |
Centrifuge | Eppendorf | # 5427 R | For centrifugation of homogenized tissue |
Cryostat microtome | Leica Biosystems | # CM 3050 S | For cutting the embedded tissue prior to staining; Other model and manufacturer may be used |
Forceps, Dumont, # 3 | F.S.C. (Fine Science Tools) | # 11231-30 | For handling of spinal cord after extrusion; Other manufacturer/type may be used |
Forceps, Dumont, # 5 | F.S.C. (Fine Science Tools) | # 11252-20 | For isolation of DRGs (adult mouse, adult rat, pup); Other manufacturer may be used |
Isoflurane (furane) IsoFlo Vet 100 % | Abbott | # 002185 | For euthanization; Other manufacturer may be used; CAUTION: toxic |
Iso-pentane GPR rectapur | VWR chemicals | # 24872.298 | For snap-freezing of tissue; Other manufacturer may be used; CAUTION: toxic |
Microtome | Leica Biosystems | # RM 2155 | For sectioning of paraffin embedded tissue; Other model and manufacturer may be used |
Paraffin wax pellets | Sigma-Aldrich | # 76243 | For paraffin embedding; Other manufacturer may be used |
Paraffin tissue embedding station | Leica Biosystems | # EG1160 | For paraffin embedding of tissue for later sectionning; Other model and manufacturer may be used |
Pellet pestel, motor cordless | Sigma-Aldrich | # Z359971-1EA | For mechanical homogenization of isolated tissue prior to Western blotting; Other manufacturer may be used |
Petri dish, 35 mm | Thermo Fischer Scientific | # 121V | For storage of isolated DRGs; Other manufacturer and size may be used |
Petri dish, 100 mm | Sigma-Aldrich | # P7741 | For spinal cord extrusion; Other manufacturer and size may be used |
Phosphatase inhibitor, Phosstop | Sigma-Aldrich | # 04906845001 | Phosphatase inhibitor cocktail for addition to TNE-lysis buffer if needed; Other manufacturer may be used |
Pipette tip, 1-200 μl, no filter | Sarstedt | # 70.1189.105 | For hydraulic extrusion; Other manufacturer may be used |
Protease inhibitor, Complete | Sigma-Aldrich | # 05892791001 | Protease inhibitor cocktail for addition to TNE-lysis buffer if needed; Other manufacturer may be used |
RNAlater solution | Sigma-Aldrich | # R0901 | For RNA stabilization for storage; Other manufacturer may be used |
Rneasy Protect Mini KiT | Qiagen | # 74124 | For RNA isolation; Other manufacturer may be used |
Scalpel; Swann-Morton surgical blade no. 11 | Swann-Morton | # REF0203 | For isolation of spinal cord lumbar area; Other manufacturer/type may be used |
Scissors, straight, type 3, 25 mm cutting edge | Bochem | # 4070 | For isolation of spine; Other manufacturer/type may be used |
Scissors, 130 mm cutting edge | Hounisen | # 1902.0130 | For isolation of spinal cord (adult rat) |
Spring scissors, straight, 8 mm cutting edge | F.S.C. (Fine Science Tools) | # 15009-08 | For cutting open the spinal column prior to isolation of DRGs (pup) and for isolation of DRGs (adult mouse, adult rat, pup); Other manufacturer may be used |
Standard syringes, 2.5 ml, 5 ml, 10 ml | Terumo | # SS02SE1; # SS05SE1; # SS10SE1 | For hydraulic extrusion; Other manufacturer may be used |
Stereomicroscope MZ12.5 with objective 1x and eyepiece 10x | Leica | # 10446370 | Other manufacturer/type may be used |
Sterile PBS | GIBCO | # 10010-015 | For hydraulic extrusion; Can also be made according to standard protocols |
Syringe needle 23 G x 1", 0.6 x 25 mm | Terumo Neolus | # NN-2325R | For hydraulic extrusion in pups; Other manufacturer/type may be used |
Syringe needle 18 G x 1 1/2, 1.2 x 40 mm | Terumo Neolus | # NN-1838S | Alternative to pipette tip for hydraulic extrusion in adult mice; Other manufacturer may be used |
Tissue-Tek | Sakura | # 4583 | Tssue embedding material for later cryosectionning |
TNE-lysis buffer | VWR chemicals | # 10128-582 | For tissue lysis prior to Western blotting; Other manufacturer may be used; Can also be made according to standard protocols |