L'ARN monocellulaire-séquentiel des sous-ensembles définis des cellules ganglionnaires rétiniennes
Summary
Ici, nous présentons une approche combinatoire pour classer les types de cellules neuronales avant l'isolement et pour la caractérisation ultérieure des transcriptomes monocellulaires. Ce protocole optimise la préparation d'échantillons pour un séquençage d'ARN réussi (RNA-Seq) et décrit une méthodologie conçue spécifiquement pour une meilleure compréhension de la diversité cellulaire.
Abstract
La découverte de marqueurs spécifiques de type cellulaire peut donner un aperçu de la fonction cellulaire et des origines de l'hétérogénéité cellulaire. Avec une poussée récente pour une meilleure compréhension de la diversité neuronale, il est important d'identifier des gènes dont l'expression définit diverses sous-populations de cellules. La rétine sert d'excellent modèle pour l'étude de la diversité du système nerveux central, car elle est composée de multiples types de cellules majeures. L'étude de chaque classe majeure de cellules a donné des marqueurs génétiques qui facilitent l'identification de ces populations. Cependant, de multiples sous-types de cellules existent dans chacune de ces principales classes de cellules rétiniennes, et quelques-uns de ces sous-types connaissent des marqueurs génétiques, même si beaucoup ont été caractérisés par une morphologie ou une fonction. Une connaissance des marqueurs génétiques pour les sous-types individuels de la rétine permettrait l'étude et la cartographie des cibles cérébrales liées à des fonctions visuelles spécifiques et pourrait également donner un aperçu des réseaux génétiques quiMaintenir la diversité cellulaire. Les avenues actuelles utilisées pour identifier les marqueurs génétiques des sous-types présentent des inconvénients tels que la classification des types de cellules suite au séquençage. Cela présente un défi pour l'analyse des données et nécessite des méthodes de validation rigoureuses pour s'assurer que les grappes contiennent des cellules de même fonction. Nous proposons une technique pour identifier la morphologie et la fonctionnalité d'une cellule avant l'isolement et le séquençage, ce qui permettra une identification plus facile des marqueurs spécifiques aux sous-types. Cette technique peut être étendue aux types de cellules non neuronales, ainsi qu'à des populations rares de cellules présentant des variations mineures. Ce protocole produit des données d'excellente qualité, car de nombreuses bibliothèques ont fourni des profondeurs de lecture supérieures à 20 millions de lectures pour des cellules individuelles. Cette méthodologie remédie à plusieurs des obstacles présentés par les cellules monocellulaires RNA-Seq et peut être adaptée pour les chercheurs visant à faire connaître les types de cellules d'une manière simple et efficace.
Introduction
La diversité neuronale est observée dans tout le système nerveux central, en particulier dans la rétine des vertébrés, un tissu hautement spécialisé constitué de 1 type de cellules gliaires et 6 neuronales provenant d'une population de cellules progénitrices rétiniennes 1 , 2 , 3 . De nombreux sous-types de cellules peuvent être classés fonctionnellement, morphologiquement et génétiquement. Le but de ce protocole est de lier la variabilité génétique des types de cellules à leurs caractéristiques fonctionnelles et / ou morphologiques identifiables. Un certain nombre de gènes ont été identifiés pour la classification des cellules, mais de nombreux sous-types continuent à ne pas caractériser, car ils représentent une petite fraction de la population globale. L'identification des gènes dans ces sous-types spécifiques permettra une meilleure compréhension de la diversité neuronale au sein de la rétine et peut également éclairer la diversification des cellules neuronales ailleurs. FuDe plus, les études à une seule cellule permettent de découvrir de nouveaux types de cellules, ce qui pourrait avoir été négligé en raison de leur faible représentation parmi la population générale 4 , 5 , 6 , 7 .
L'un des avantages de la transcriptomie monocellulaire est que des marqueurs uniques ou des combinaisons de marqueurs qui définissent un sous-type cellulaire particulier peuvent être découverts. Ceux-ci peuvent ensuite être utilisés pour obtenir un accès génétique à ce type de cellule pour différentes manipulations. Par exemple, nous utilisons ce protocole pour caractériser les gènes spécifiques du type cellulaire d'un sous-ensemble de cellules ganglionnaires rétiniennes qui expriment le photopigment de la mélanopsine. L'utilisation d'un marqueur fluorescent dans des cellules ganglionnaires rétiniennes exprimant la mélanopsine permet d'étudier ces cellules car elles sont regroupées en raison de leur expression d'un gène connu. Fait intéressant, il existe cinq sous-types connus de cette popu cellulaireDans la retine de la souris 8 . Ainsi, pour isoler l'ARN des cellules de chaque type, nous avons utilisé des classifications morphologiques établies dans le modèle transgénique pour identifier chaque sous-type avant l'isolement cellulaire. Cette technique permet la caractérisation des cellules ainsi que leur isolement directement à partir de la rétine, sans nécessiter de dissociation tissulaire, ce qui peut provoquer une réponse au stress dans les cellules et la contamination due à des dendrites coupées 9 .
Une multitude de nouvelles techniques sont apparues au cours des dernières années alors que la méthode RNA-Seq continue de se développer. Ces outils permettent une acquisition maximale des cellules et une plus grande rentabilité tout en abordant la question à l'étude 4 , 7 , 10 , 11 , 12 , 13 . Cependant, pendantCes techniques ont été d'excellents tremplins, il existe un certain nombre d'obstacles encore rencontrés que ce protocole peut traiter. Tout d'abord, bon nombre des procédures actuelles isolent les cellules du tissu dissocié et tentent d'utiliser soit l'analyse des composants principaux, soit le regroupement hiérarchique post-hoc pour déterminer la classification des cellules. S'appuyer sur ces outils pour classer les sous-types peut ne pas produire de résultats fiables et peut forcer l'un à trouver de nouvelles façons de valider ces données pour la corrélation d'un marqueur génétique avec un type de cellule fonctionnelle. L'exigence de dissociation dans d'autres protocoles peut parfois entraîner des lésions tissulaires et peut entraîner la rupture des processus neuronaux, entraînant une perte potentielle d'ARNm. En outre, dans les préparations de cellules dissociées, les réponses au stress peuvent commencer à affecter les transcriptomes de ces cellules 14 . Ce protocole surmonte ces défis en déterminant le type de cellule fonctionnelle avant l'isolement, et il maintient mieux le hLa santé des cellules en gardant le tissu rétinien intact.
Une technique a été introduite en 2014 et consistait en l'analyse in vivo du transcriptome des cellules vivantes 15 . Bien que cette technique permette l'examen du transcriptome avec une rupture mécanique minimale du tissu, il manque la capacité de classer les types de cellules spécifiques dans le tissu avant d'examiner leurs transcriptomes sans utiliser une souris journaliste très spécifique. Notre protocole ne nécessite pas de journaliste spécifique, car nous utilisons le remplissage cellulaire et l'électrophysiologie pour caractériser les cellules avant leur isolement. Une autre limitation de ce protocole précédent est qu'il nécessite une longueur d'onde spécifique pour exciter l'élément photoactivable, alors que notre protocole permet l'utilisation d'un reporter fluorescent et d'un colorant fluorescent, qui sont facilement disponibles ou peuvent être choisis par chaque laboratoire individuellement. Pourtant, d'autres laboratoires ont épousé les deux méthodes de l'électrL'ophysiologie et la transcriptomie pour l'étude de la diversité cellulaire. L'utilisation d'enregistrements patch-clamp pour caractériser la fonction d'une cellule avant son isolement a été réalisée sur des neurones dissociés 16 et, dans certains cas, elle a précédé l'utilisation de l'analyse par microarrays 17 pour ces études. Les mêmes complications sont rencontrées par ces approches, car elles nécessitent une dissociation des tissus ou l'utilisation de la technologie des microarray, qui repose sur l'hybridation des échantillons sur les sondes disponibles. L'un des progrès les plus récents a été le développement de Patch-Seq, une technique qui combine l'utilisation des enregistrements de patch-clamp et de la technologie RNA-Seq pour comprendre les cellules des tranches de cerveau entier 18 . Bien que cette technique ait ses similitudes avec le protocole présenté ici, il est à nouveau important de noter que notre approche permet au tissu de rester intact pour la santé des cellules. Ici, nous présentons un protocole pour l'optimisationDe cette alliance, qui génère des bibliothèques à une seule cellule de haute qualité pour l'utilisation d'ARN-Seq pour obtenir une profondeur de lecture et une couverture de cartographie élevées.
Protocol
Representative Results
Discussion
Notre protocole démontre, par un guide rapide et facile à utiliser, une méthode pour préparer des cellules individuelles de classes morphologiques identifiées pour un séquençage de haute qualité, avec peu de blessures à l'échantillon. Dans le présent manuscrit, les cellules ganglionnaires de la rétine intrinsèquement photosensibles sont morphologiquement caractérisées, isolées et préparées pour l'ARN-Seq. Des contraintes cellulaires peuvent se produire pendant la manipulation de la rétine; Pou…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Nous souhaitons remercier Jennifer Bair et Einat Snir, ainsi que l'Institut de génétique humaine de l'Université de l'Iowa pour leur aide à la préparation et à la gestion des échantillons.
Materials
| Ames' Medium | Sigma Aldrich | A1420-10X1L | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S8875 | |
| K-gluconate | Spectrum Chemical | PO178 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma Aldrich | D5758 | |
| Alexa Fluor 594 Hydrazide | Invitrogen | A10442 | |
| Collagenase | Worthington Biochemical | LS005273 | |
| Hyaluronidase | Worthington Biochemical | LS002592 | |
| Petri dish (35mm diameter) | Thermo Fisher Scientific | 153066 | |
| Ophthalmologic scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| Microplate Shaker | Fisher Scientific | 13-687-708 | |
| Glass Micropipette | Sutter | BF120-69-10 | |
| Micropipette Puller | Sutter | P-1000 horizontal pipette puller | |
| 1mL syringe | Fisher Scientific | 14-823-2F | |
| Flexible tubing | Fisher Scientific | 14-171 | |
| TCL lysis buffer | Qiagen | 1031576 | Lysis Buffer 1 |
| β-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
| RNase-Free Water | Qiagen | 129112 | |
| 0.2 ml PCR tubes | Eppendorf | 30124359 | |
| Ethyl Alcohol, Pure | Sigma Aldrich | E7023 | Ethanol |
| Analog Vortex Mixer | Thermo Fisher Scientific | 02215365 | Vortex |
| Mini Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| Agencourt RNAClean XP Beads | Beckman Coulter | A63987 | RNA magnetic beads |
| MagnaBlot II Magnetic Separator | Promega | V8351 | Magnetic stand |
| 1.5 ml MCT Graduated Tubes | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Smart-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit | Clontech | 634888 | Reagents for Reverse Transcription and PCR Amplification |
| 10X Lysis Buffer | Lysis Buffer 2 | ||
| 5X Ultra Low First-Strand Buffer | Buffer 1 | ||
| 3' SMART-Seq CDS Primer II A | Primer II | ||
| SMART-Seq v4 Oligonucleotide | Oligonucleotide | ||
| SMARTScribe Rverse Transcriptase | Reverse Transcriptase | ||
| 2X SeqAmp PCR Buffer | PCR Buffer | ||
| PCR Primer II A | PCR Primer | ||
| SeqAmp DNA Polymerase | DNA Polymerase | ||
| Mastercycler pro S | Eppendorf | 950030020 | Thermocycler |
| Agencourt AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | DNA magnetic beads |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA | |
| HS Bioanalyzer Chips & Reagents | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| Qubit HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | For the calculation of sample concentrations |
| Qubit Assay Tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q32866 | |
| Nextera XT DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-131-1024 | Reagents for Tagmentation and Index Coupling |
| TD Buffer | Buffer 2 | ||
| ATM | Tagmentation Mix | ||
| NT Buffer | Tagmentation Neutralizing Buffer | ||
| NPM | PCR Master Mix | ||
| Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | Indices for Tagmentation |
| N501 | White 1 | ||
| N502 | White 2 | ||
| N701 | Orange 1 | ||
| N702 | Orange 2 | ||
| HiSeq 2500 | Illumina | SY-401-2501 | For completing sequencing of samples |
Riferimenti
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