망막 신경절 세포의 정의 된 서브 세트의 단일 세포 RNA-Seq
Summary
여기에서, 우리는 단클론 성 전 사체의 단리 및 후속 특성 규명을 위해 연결 세포 유형을 분류하기위한 조합 접근법을 제시한다. 이 프로토콜은 성공적인 RNA 시퀀싱 (RNA-Seq)을위한 샘플 준비를 최적화하고 세포 다양성의 강화 된 이해를 위해 특별히 고안된 방법을 설명합니다.
Abstract
세포 유형별 마커의 발견은 세포 기능과 세포 이질의 기원에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 최근 뉴런의 다양성에 대한 이해를 높이기 위해 발현이 세포의 여러 하위 집단을 정의하는 유전자를 확인하는 것이 중요합니다. 망막은 중추 신경계의 다양성 연구를위한 훌륭한 모델로, 여러 주요 세포 유형으로 구성되어 있습니다. 각 주요 부류의 세포에 대한 연구는 이러한 개체군의 동정을 용이하게하는 유전자 마커를 산출했다. 그러나, 세포의 여러 하위 유형이 각각의 주요 망막 세포 클래스 내에 존재하며, 이들 아형의 유형 중 일부는 형태 학적 또는 기능적 특징으로 특징 지어졌지만 유전 적 마커를 가지고있다. 개별 망막 아형에 대한 유전 적 마커에 대한 지식은 특정 시각 기능과 관련된 뇌 표적의 연구와지도 작성을 가능하게하고 유전자 네트워크에 대한 통찰력을 제공한다.세포 다양성을 유지하라. 아형의 유전 적 표지자를 확인하는 데 사용되는 현재의 방법은 서열 분석에 따른 세포 유형의 분류와 같은 단점을 가지고있다. 이는 데이터 분석에 대한 도전 과제이며 클러스터에 동일한 기능의 셀이 포함되도록하기 위해 엄격한 검증 방법이 필요합니다. 우리는 분리 및 시퀀싱 이전에 세포의 형태 및 기능을 확인하여 하위 유형별 마커를 쉽게 식별 할 수있는 기술을 제안합니다. 이 기술은 비 신경 세포 유형뿐만 아니라 사소한 변형이있는 희귀 한 세포 집단까지 확장 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 우수한 품질의 데이터를 제공하며, 많은 라이브러리가 단일 셀에 대해 2,000 만 건 이상의 읽기 깊이를 제공합니다. 이 방법론은 Single-cell RNA-Seq이 제시하는 장애물 중 많은 부분을 극복하고 직접적이고 매우 효율적인 방법으로 세포 유형을 규명하고자하는 연구자에게 적합 할 수 있습니다.
Introduction
뉴런의 다양성은 중추 신경계, 특히 척수 망막에서 관찰되며 망막 전구 세포 1 , 2 , 3 의 한 집단에서 유래 한 1 개의 신경교 세포와 6 개의 신경 세포 유형으로 구성된 고도로 전문화 된 조직이다. 세포의 많은 아형들은 기능적으로, 형태 학적으로, 그리고 유 전적으로 분류 될 수 있습니다. 이 프로토콜의 목표는 세포 유형의 유전 적 다양성을 식별 가능한 기능적 및 / 또는 형태 학적 특성에 연결하는 것입니다. 세포의 분류를 위해 많은 유전자가 확인되었지만 많은 하위 유형은 전체 인구의 작은 부분을 대표하므로 특성화되지 않고 계속됩니다. 이러한 특정 아형 내에서의 유전자의 동정은 망막 내에서의 연결의 다양성에 대한 더 큰 이해를 가능하게 할 것이고, 다른 곳에서 신경 세포의 다양 화를 밝힐 수도있다. 부더구나, 단세포 연구는 새로운 세포 유형의 발견을 허용하며, 이는 전체 인구 중 낮은 수치로 인해 간과되었을지도 모르는 4 , 5 , 6 , 7 .
단일 세포 transcriptomics의 이점 중 하나는 특정 세포 아형을 정의하는 고유 마커 또는 마커의 조합을 발견 할 수 있다는 것입니다. 이것들은 다른 조작을 위해 그 세포 유형에 대한 유전자 접근을 얻기 위해 사용될 수 있습니다. 예를 들어, 우리는 photopigment melanopsin을 표현하는 망막 신경절 세포의 하위 집합의 세포 유형 특정 유전자를 특성화하기 위해이 프로토콜을 사용하고 있습니다. 망막 신경절 세포를 나타내는 멜라닌 신 (melanopsin)을 발현하는 세포에서 형광 마커를 사용하면 알려진 유전자의 발현으로 인해 이들 세포가 함께 모이기 때문에 이들 세포를 연구 할 수 있습니다. 흥미롭게도,이 세포 popu의 다섯 가지 알려진 아형이 있습니다마우스 망막 8에서 . 따라서, 각 유형의 세포에서 RNA를 분리하기 위해, 우리는 세포 분리 전에 각 아형을 확인하기 위해 형질 전환 모델 내에서 확립 된 형태 학적 분류를 사용했다. 이 기술은 조직 해리가 필요없는 세포의 특성화와 망막에서의 직접적인 분리를 가능하게합니다. 조직 해리없이 세포 내에서 스트레스 반응을 일으키고 절단 된 수상 돌기로 인한 오염을 유발할 수 있습니다.
RNA-Seq 방법이 계속 발전함에 따라 지난 몇 년 동안 수많은 새로운 기술이 밝혀졌습니다. 이 도구를 사용하면 4 , 7 , 10 , 11 , 12 , 13 번 문제에 접근하면서 최대의 셀 획득 및 비용 효율성을 극대화 할 수 있습니다. 그러나,이 기술은 우수한 디딤돌이었으며, 여전히이 프로토콜이 해결할 수있는 많은 장애물이 있습니다. 첫째, 현재의 많은 절차는 해리 된 조직으로부터 세포를 분리하고, 세포 분류를 결정하기 위해 주성분 분석 또는 사후 (post-hoc) 계층 적 클러스터링을 사용하려고 시도한다. 이러한 유형의 도구를 사용하여 하위 유형을 분류하면 신뢰할만한 결과를 얻을 수 없으며 기능성 세포 유형에 대한 유전 적 표지의 상관 관계에 대해이 데이터의 유효성을 검사하는 새로운 방법을 강요 할 수 있습니다. 다른 프로토콜에서 해리에 대한 요구 사항은 때때로 조직 손상을 초래할 수 있으며, 신경 프로세스가 절단되어 mRNA의 잠재적 손실을 초래할 수 있습니다. 또한, 해리 세포 준비에서 스트레스 반응은 이러한 세포의 transcriptomes 14 영향을 시작할 수 있습니다. 이 프로토콜은 격리 이전에 기능 세포 유형을 결정함으로써 이러한 문제를 극복하고, h망막 조직을 손상시키지 않으면 서 세포의 증식.
한 기술은 2014 년에 도입 되었고 생체 내 전 사체의 생체 내 분석으로 구성되었습니다 15 . 이 기술은 조직에 대한 기계적 파괴를 최소화하면서 전 사체의 검사를 허용하지만 매우 특이적인 기자 마우스를 사용하지 않고 전 사체를 검사하기 전에 조직 내 특정 세포 유형을 분류하는 능력이 부족합니다. 우리의 프로토콜은 특정 리포터를 필요로하지 않습니다. 왜냐하면 우리는 세포 충전 및 전기 생리학을 이용하여 격리 전에 세포를 특성화하기 때문입니다. 이 이전 프로토콜의 또 다른 한계는 특정 파장이 광활성 요소를 여기시키는 데 필요하다는 것인데, 우리 프로토콜은 형광 리포터와 형광 염료의 사용을 허용하고 있습니다.이 리포터와 형광 염료는 쉽게 사용할 수 있거나 각 실험실별로 개별적으로 선택할 수 있습니다. 아직도, 다른 실험실은 electr의 2 가지의 방법을 결혼했다세포 다양성 연구를위한 생리학 및 전이 학. 분리 이전에 세포의 기능을 특성화하기위한 패치 – 클램프 기록의 사용은 해리 된 뉴런 16에서 수행 되었고, 어떤 경우에는 이러한 연구를 위해 마이크로 어레이 분석 17 을 사용하기도했다. 이러한 접근법에서 동일한 합병증이 발생합니다. 조직 분해 또는 이용 가능한 프로브에 대한 시료의 하이브리드 화에 의존하는 마이크로 어레이 기술의 사용이 필요하기 때문입니다. 가장 최근의 진보 중 하나는 전체 뇌 조각에서 세포를 이해하기 위해 패치 클램프 녹음과 RNA-Seq 기술을 결합한 기술인 Patch-Seq의 개발이었습니다. 이 기술은 여기에 제시된 프로토콜과 유사하지만, 우리의 접근 방식은 조직이 세포의 건강을 유지하기 위해 그대로 유지된다는 것을 다시 한번 주목하는 것이 중요합니다. 여기서는 최적화를위한 프로토콜을 제시합니다.이는 RNA-Seq을 사용하여 높은 판독 깊이와 매핑 범위를 얻기 위해 고품질의 단일 세포 라이브러리를 생성합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리의 프로토콜은 신속하고 사용하기 쉬운 가이드를 통해 표본에 거의 손상을주지 않으면 서 높은 수준의 서열 분석을 위해 확인 된 형태 학적 분류의 단일 세포를 준비하는 방법을 보여줍니다. 본 원고에서 본질적으로 감광성 망막 신경절 세포는 형태 학적으로 특성화되고 분리되고 RNA-Seq에 대해 준비된다. 망막 처리 도중 세포 응력이 발생할 수 있습니다. 이러한 이유로 우리는 4 시간 이상 사…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 샘플을 준비하고 취급하는 데 도움을 준 Jennifer Bair와 Einat Snir, Iowa Institute for Human Genetics를 인정하고 싶습니다.
Materials
| Ames' Medium | Sigma Aldrich | A1420-10X1L | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma Aldrich | S8875 | |
| K-gluconate | Spectrum Chemical | PO178 | |
| EGTA | Sigma Aldrich | E4378 | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H3375 | |
| Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma Aldrich | D5758 | |
| Alexa Fluor 594 Hydrazide | Invitrogen | A10442 | |
| Collagenase | Worthington Biochemical | LS005273 | |
| Hyaluronidase | Worthington Biochemical | LS002592 | |
| Petri dish (35mm diameter) | Thermo Fisher Scientific | 153066 | |
| Ophthalmologic scissors | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-30 | |
| Microplate Shaker | Fisher Scientific | 13-687-708 | |
| Glass Micropipette | Sutter | BF120-69-10 | |
| Micropipette Puller | Sutter | P-1000 horizontal pipette puller | |
| 1mL syringe | Fisher Scientific | 14-823-2F | |
| Flexible tubing | Fisher Scientific | 14-171 | |
| TCL lysis buffer | Qiagen | 1031576 | Lysis Buffer 1 |
| β-mercaptoethanol | Sigma Aldrich | M3148 | |
| RNase-Free Water | Qiagen | 129112 | |
| 0.2 ml PCR tubes | Eppendorf | 30124359 | |
| Ethyl Alcohol, Pure | Sigma Aldrich | E7023 | Ethanol |
| Analog Vortex Mixer | Thermo Fisher Scientific | 02215365 | Vortex |
| Mini Centrifuge | Thermo Fisher Scientific | 05-090-100 | |
| Agencourt RNAClean XP Beads | Beckman Coulter | A63987 | RNA magnetic beads |
| MagnaBlot II Magnetic Separator | Promega | V8351 | Magnetic stand |
| 1.5 ml MCT Graduated Tubes | Thermo Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| Smart-Seq v4 Ultra Low Input RNA Kit | Clontech | 634888 | Reagents for Reverse Transcription and PCR Amplification |
| 10X Lysis Buffer | Lysis Buffer 2 | ||
| 5X Ultra Low First-Strand Buffer | Buffer 1 | ||
| 3' SMART-Seq CDS Primer II A | Primer II | ||
| SMART-Seq v4 Oligonucleotide | Oligonucleotide | ||
| SMARTScribe Rverse Transcriptase | Reverse Transcriptase | ||
| 2X SeqAmp PCR Buffer | PCR Buffer | ||
| PCR Primer II A | PCR Primer | ||
| SeqAmp DNA Polymerase | DNA Polymerase | ||
| Mastercycler pro S | Eppendorf | 950030020 | Thermocycler |
| Agencourt AMPure XP Beads | Beckman Coulter | A63881 | DNA magnetic beads |
| 2100 Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA | |
| HS Bioanalyzer Chips & Reagents | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| Qubit HS Assay Kit | Thermo Fisher Scientific | Q32851 | For the calculation of sample concentrations |
| Qubit Assay Tubes | Thermo Fisher Scientific | Q32856 | |
| Qubit 2.0 Fluorometer | Thermo Fisher Scientific | Q32866 | |
| Nextera XT DNA Sample Preparation Kit | Illumina | FC-131-1024 | Reagents for Tagmentation and Index Coupling |
| TD Buffer | Buffer 2 | ||
| ATM | Tagmentation Mix | ||
| NT Buffer | Tagmentation Neutralizing Buffer | ||
| NPM | PCR Master Mix | ||
| Nextera XT Index Kit | Illumina | FC-131-1001 | Indices for Tagmentation |
| N501 | White 1 | ||
| N502 | White 2 | ||
| N701 | Orange 1 | ||
| N702 | Orange 2 | ||
| HiSeq 2500 | Illumina | SY-401-2501 | For completing sequencing of samples |
Riferimenti
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