Øresvinet delfiner (Tursiops truncatus) sædcellerne: indsamling, kryopræservering og heterolog In Vitro fertilisering
Summary
Vi præsenterer her, protokoller, der er brugt med succes til dolphin sædcellerne samling, kryopræservering og heterolog IVF ydeevne ved hjælp af kvæg oocyter.
Abstract
Brug af kryopræserverede dolphin sædcellerne letter udveksling af genetiske materiale mellem akvatiske parker og gør sædcellerne adgang til laboratorier for undersøgelser til at fremme vores forståelse af havpattedyr reproduktion. Heterolog IVF, en erstatning for homologe IVF, kunne give et middel til at teste sædceller frugtbarhed potentiale; at studere gamet fysiologi og tidlig embryo udvikling; og for at undgå brugen af værdifulde dolphin oocytter, som er vanskelig at opnå. Vi præsenterer her, protokoller, der med succes har brugt til at indsamle og cryopreserve dolphin sædcellerne. Opsamling af sæd er udført af manuel stimulation på trænede delfiner. Kryopræservering er udført ved hjælp af en TRIS æggeblomme baseret extender med glycerol. Derudover præsenterer vi en protokol, der beskriver heterolog IVF bruger dolphin sædcellerne og kvæg oocyter og som kontrollerer den hybride karakter af den resulterende embryo ved hjælp af PCR. Heterolog befrugtning rejser spørgsmål om befrugtning og kan bruges som et redskab til at studere gamet fysiologi og tidlig embryo udvikling. Derudover viser heterolog IVF succes potentiale af denne teknik til at teste dolphin sperm befrugtende kapacitet, som er værd at yderligere undersøgelse.
Introduction
Assisteret reproduktionsteknologi er dårligt udviklet hos vilde dyr, herunder havpattedyr. Manglen på følsomme metoder til at vurdere sperm gødskning succes bidrager til den langsomme udvikling af reproduktive teknologier i arter som dolphin. Det var ikke indtil for nylig, at de skelsættende grundparametrene for øresvin (Tursiops truncatus) var rapporteret1,2. Men variabler såsom motilitet og morfologi, selv om udbredt, giver begrænsede oplysninger om reproduktiv effektivitet. Den bedste indikator for sædkvalitet er evalueringen af gødskning potentiale.
For nylig, vores gruppe bruges en metode til at vurdere dolphin sperm befrugtende potentiale ved at vurdere mandlige pronuclear dannelse og/eller hybrid embryo dannelsen efter heterolog IVF bruge zona intakt bovin oocyter3. Brugen af delfin-kvæg heterolog IVF har vigtige fordele over homologe IVF, som det overvinder vanskeligheden ved at opnå dolphin oocyter og letter brugen af velafprøvede in vitro- kvæg oocyt modning systemer. For at undgå arter specificitet, udføres heterolog befrugtning normalt i mangel af ZP. Selv om det giver mulighed for evalueringen af de acrosome-reagerede sædcellerne evne til at smelte med vitelline membranen, svækker det evaluering af andre funktioner med relation til befrugtning. Den beskrevne procedure bruger zona intakt oocyter og tillader evaluering af følgende parametre: sperm zona bindende og vedhæftet fil, penetration, polyspermy, pronuclear dannelse og hybride embryoner kavalergang.
Her, præsenterer vi flere protokoller for sperm samling, grundlæggende sædanalyse, sædcellerne frysning samt evaluering af dolphin sperm funktionalitet ved at vurdere mandlige pronuclear og/eller hybrid embryo dannelsen efter heterolog IVF bruge zona intakt kvæg oocyter.
Protocol
Representative Results
Discussion
For mange forskellige pattedyr arter er der forskellige fordele ved at bruge optøede sperm. Disse omfatter evnen til at overføre værdifuldt genetisk materiale, potentialet for verdensomspændende distribution, lav risiko for kontaminering, og evnen til at bevare mandlige gameter i årtier. Brug af kryopræserverede sæd er afgørende for Øresvinet, fordi denne art er beskyttet i henhold til tillæg II i CITES, som begrænser transport og udveksling af dyr mellem forskellige akvatiske parker. Delfiner transport er en …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
hans arbejde blev finansieret af det spanske ministerium for økonomi og konkurrenceevne (AGL2015-70140-R til D. Rizos), AGL2015-66145R A. Gutierrez-Adan og J. F. Pérez-Gutiérrez og Seneca fundament af Murcia (Grant 20040/Kim/16 til F. García-Vázquez)
Materials
| FERT-TALP medium | Merck | |
| TCM-199 | Sigma | M-4530 |
| Hoechst 33342 | Sigma | B-2261 |
| 4-well dishes | Nunc | 176740 |
| Density gradient BoviPure | Nidacon International | BP-100 |
| Washing solution Boviwash | Nidacon International | BW-100 |
| Magnesium chloride | Promega | A35 1H |
| Sterile water | Mili Q sintesis A10 Millipore | A35 1H |
| Buffer Tris Borate EDTA | Sigma | T4415 |
| MB agarose | Biotools | 20.012 |
| 5X GoTaq flexi buffer | Mili Q sintesis A10 Millipore | M 890 A |
| MB agarose | Biotools | 20.012 |
| Taq polymerase | Promega | |
| SafeView | NBS Biologicals Ltd. | M 890 A |
| Makler counting chamber | Sefi Medical | |
| Thoma chamber | Hecht-Assistant | |
| pHmeter MicropH 2000 | Crison Instruments | |
| Osmometer Advanced micro osmometer 3300 | Norwood | |
| Computer assisted sperm analysis system | Projectes y Serveis R+D | |
| Stereomicroscope MZ 95 | Leica | |
| Epifluorescent optics Eclipse Te300 | Nikon | |
| Confocal assistant 4.02 software | Bio-Rad | 3D analysis software |
| Confocal laser scanning microscopy | Bio-Rad | |
| Micropippetes (P2. P20, P200, P1000) | Gilson | |
| Microcentrifuge tubes | VWR | |
| UV iluminator | Bio-Rad | |
| PCR Thermal cycler Primus 96 Plus | MWG AG Biotech |
Riferimenti
- Montano, G. A., et al. Evaluation of motility, membrane status and DNA integrity of frozen-thawed bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa after sex-sorting and recryopreservation. Reproduction. 143 (6), 799-813 (2012).
- Sánchez-calabuig, M. J., et al. Validation of a field based chromatin dispersion assay to assess sperm DNA fragmentation in the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Reprod Domest Anim. 49 (5), 761-768 (2014).
- Sánchez-calabuig, M. J., et al. Heterologous murine and bovine IVF using bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa. Theriogenology. 84 (6), 983-994 (2015).
- Keller, K. V. Training of the Atlantic bottlenose dolphins (Tursiops truncatus) for artificial insemination. IAAAM. 14 (22), 22-24 (1986).
- Robeck, T. R., O’brien, J. K. Effect of cryopreservation methods and precryopreservation storage on bottlenose dolphin (Tursiops truncatus) spermatozoa. Biol Reprod. 70 (5), 1340-1348 (2004).
- Coy, P., et al. Hardening of the zona pellucida of unfertilized eggs can reduce polyspermic fertilization in the pig and cow. Reproduction. 135 (1), 19-27 (2008).
- Seager, S., W, G., Moore, L., Platz, C., Kirby, V. Semen collection (electroejaculation), evaluation and freezing in the Atlantic bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Proceedings of the American Association of Zoo Veterinarians. 136, (1981).
- Schroeder, J. P., Leatherwood, S., Reeves, R. R. Breeding Bottlenose Dolphins in captivity. The Bottlenose dolphin. , 447-460 (1990).
- Sánchez-Calabuig, M. J., et al. Effect of cryopreservation on the sperm DNA fragmentation dynamics of the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Reprod Domest Anim. 50 (2), 227-235 (2015).
- Robeck, T. R., et al. Estrous cycle characterisation and artificial insemination using frozen-thawed spermatozoa in the bottlenose dolphin (Tursiops truncatus). Reproduction. 129 (5), 659-674 (2005).
- Robeck, T. R., et al. Development and evaluation of deep intra-uterine artificial insemination using cryopreserved sexed spermatozoa in bottlenose dolphins (Tursiops truncatus). Anim Reprod Sci. 139 (1-4), 168-181 (2013).
- Schroeder, J. P., Leatherwood, S., Reeves, R. R. Breeding Bottlenose Dolphins in captivity. The Bottlenose dolphin. , 447-460 (1990).
- Madeddu, M., et al. Effect of cooling rate on the survival of cryopreserved rooster sperm: Comparison of different distances in the vapor above the surface of the liquid nitrogen. Anim Reprod Sci. , (2016).
