Biofysiske karakterisering af flagel motoriske funktioner

Summary

Recent findings suggest that bacterial flagellar motors sense a variety of environmental signals and remodel in response. The bead-assays discussed here are expected to help explain the role of remodeling in cellular adaptation to environmental stressors.

Abstract

The role of flagellar motors in bacterial motility and chemotaxis is well-understood. Recent discoveries suggest that flagellar motors are able to remodel in response to a variety of environmental stimuli and are among the triggers for surface colonization and infections. The precise mechanisms by which motors remodel and promote cellular adaptation likely depend on key motor attributes. The photomultiplier-based bead-tracking technique presented here enables accurate biophysical characterization of motor functions, including adaptations in motor speeds and switch-dynamics. This approach offers the advantage of real-time tracking and the ability to probe motor behavior over extended durations. The protocols discussed can be readily extended to study flagellar motors in a variety of bacterial species.

Introduction

Flagel motorer aktiverer celler til at svømme ved roterende spiralformede ekstracellulære filamenter. Mængden af moment motoren kan generere for en given længde af flagel (dvs. den tyktflydende belastning) bestemmer svømning hastigheder. På den anden side, dets evne til at skifte rotationsretning styrer cellemigrering som respons på kemikalier, en proces kendt som kemotaksi. Kemotaksis og motilitet er virulensfaktorer ^1-3, flagel motorer er blevet godt karakteriseret årene ^4. Montering tyder nu at motoren fungerer som en mechanosensor – det mekanisk detekterer tilstedeværelsen af faste substrater ^5,6. Denne evne sandsynligvis hjælper i udløsning overflade kolonisering og infektioner ^5,7. Som et resultat heraf de mekanismer, hvorved motoren sanser overflader og initierer signalering er af betydning ^8,9.

Den flagellært motor kan let studeres ved tethering den flagellum til et substrat og observere celle rotation. Opbindingen blev først opnået ved Silverman og Simon, der arbejdede med en polyhook mutant i E. coli og held knyttet kroge til glassubstrater med anti-hook antistoffer ^10. Den bundne-celle-assay aktiveret forskere til at studere svarene fra motor-kontakten til en række forskellige kemiske stimuli. For eksempel Segall og medarbejdere kemisk stimuleret tøjrede celler ved hjælp af iontoforetiske pipetter. De tilsvarende ændringer i CW _bias (den del af den tid motorerne spinde med uret, CW) muligt for dem at måle kinetikken af tilpasning i kemotaksi netværket ^11,12. Mens den tøjret celle assay var effektiv i at studere switch svar, det var kun i stand til at tilbyde indsigt i motor mekanik i et begrænset udvalg af viskose belastninger ^13. For at overvinde dette problem, Ryu og medarbejdere tøjret sfæriske, latex perler til at filament stubbe på celler fast til overflader. Perlerne blevderefter spores ved hjælp back-fokal interferometri med svage optiske fælder ^14. Ved at arbejde med perler i forskellige størrelser, kunne forskerne studere motoren over et meget bredere vifte af belastninger. Dette assay blev senere forbedret af Yuan og Berg, som udviklede en fotomultiplikator-baserede perle-sporing teknik kombineret med belysning laser mørk-felt. Deres metode sporing af tøjrede guld nanobeads, der var så lille (~ 60 nm), at de eksterne viskøse modstand var lavere i forhold til de interne viskose modstande mod rotation ^15,16. Dette førte til målingerne af de bedst mulige hastigheder i E. coli (~ 300 Hz). I V. alginolyticus, lignende perle analyser aktiveret målinger af spinning satser ved mellemliggende viskose belastninger (~ 700 Hz) ^17. Ved at aktivere målinger af motoriske respons over hele mulige udvalg af tyktflydende belastninger (fra nul-belastning til nær-stall), de perle-analyser forudsat et vigtigt biofysisk værktøj til at forstå torque generation proces ^18,19.

For nylig har vi ændret Yuan-Berg analysen til også at omfatte optisk pincet, der gjorde det muligt at anvende præcise mekaniske stimuli til individuelle motorer ^6. Med denne teknik, viste vi, at kraft-generatorer, der roterer motoren er dynamiske mechanosensors – de remodel som reaktion på ændringer i viskose belastninger. Det er muligt, at en sådan selvjusterende udløser celle differentiering til sværmende bakterier, selv om de mekanismer fortsat uklare. Det er også sandsynligt, at de flagel motorer i andre arter er også mekanosensitive ^20, selv om der mangler direkte bevis. Her diskuterer vi fotomultiplikator-baserede (PMT) tilgang til sporing af rotation af latexperler tøjret til flagel filamenter ^15. I forhold til sporing med ultrahurtig kameraer, fotomultiplikator-setup er fordelagtigt, fordi det er relativt ligetil at spore enkelt perler i realtid og over lang durationer. Det er især nyttigt, når man studerer lang tid remodeling i flagel motordrevne komplekser på grund af miljømæssige stimuli ^21. Selvom vi detalje protokoller specifikt for E. coli, kan de let tilpasses til at studere flagel motorer i andre arter.

Protocol

1. Cell Fremstilling Vokse natten kulturer af den ønskede stamme, som bærer sticky FLIC allel 15,22 i trypton Broth (TB, 1% pepton, 0,5% NaCl) efterfulgt af podning ved 1: 100 fortynding i 10 ml frisk TB. Grow kulturen ved 33 ° C i en rysteinkubator, indtil OD600 = 0,5. Pelletere cellerne ved 1.500 xg 5 – 7 min og re-dispergere pelleten kraftigt i 10 ml filtersteriliseret motilitet puffer (MB; 10 mM phosphatbuffer: 0,05-0,06 M NaCl, 10 -4 M EDTA, 1 pM met…

Representative Results

Opsætningen fotomultiplikator er vist i figur 1A. Det er vigtigt, PMT'erne har høje følsomheder over området af bølgelængder spredes af perlerne af interesse. PMT'erne her benyttede operere i det synlige og nær-infrarøde område, og var i stand til at detektere lys spredt af perler belyst af en halogen lyskilde. De optimale lysforhold og forsyningsspændinger vil variere fra opsætningen til en anden. For opsætningen anvendes i dette arbejde, en PMT gevi…

Discussion

For at lette tøjret perle-sporing og korrekt vurdering af motor-momenter, skal følgende oplysninger revideres. Når der udføres disse målinger med pisket celler, klipning er et afgørende skridt. Klipning reducerer filament flagellært til en simpel stub, hvorved det sikres, at den viskose belastning på motoren skyldes overvejende perlen og kan estimeres inden for 10% fejl ^16. Shearing også forbedrer chancerne for at finde cirkulære baner med tæt fordelte særheder (<perle diameter ^14). …

Materials

Poly-L-lysine Solution (0.1%)	Sigma-Aldrich	P8920	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en&region=US
Polybead Microspheres	Polysciences, Inc.	7307	http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en&region=US
1 ml Luer Slip Tip Syringe	Exel Int.	26048	http://www.exelint.com/tuberculin_syringes.php
Clay Adams Intramedic Luer-Stub Adapter 23-gauge	Becton, Dickinson and Company	427565	http://www.bd.com/ds/productCenter/ES-LuerStubAdaptors.asp
Polyethylene tubing	Harvard Apparatus	59-8325	http://www.harvardapparatus.com/laboratory-polye-polyethylene-non-sterile-tubing.html
Photomultiplier Tubes	Hamamatsu	R7400U-20	Spectral response range of 300 to 920 nm, Peak wavelength 630 nm,  0.78 ns response time  http://pdf1.alldatasheet.com/datasheet-pdf/view/212308/HAMAMATSU/R7400U-20.html
3×1 mm precision slits	Edmund Optics	NT39-908	2 slits mounted at right angles to one another on photomultiplier tubes
Oscilloscope	Tektronix	TBS 1032B	Alternative brands are acceptable. Digital Oscilloscope, TBS 1000B Series, 2 Analogue, 30 MHz, 500 MSPS, 2.5 kpts  http://www.tek.com/oscilloscope/tbs1000b-digital-storage-oscilloscope
8 Pole LP/HP Filter	Krohn-Hite	3384	Alternative brands are acceptable. A frequency range from 0.1 Hz to 200 kHz is recommended.    http://www.krohn-hite.com/htm/filters/PDF/3384Data.pdf
Optiphot microscope	Nikon	NA	Any upright or inverted phase microscope can be used. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=754
50:50 (R:T) Cube Beamsplitter	ThorLabs	BS013