Biofysische karakterisering van flagellaire Motor Functies
Summary
Recent findings suggest that bacterial flagellar motors sense a variety of environmental signals and remodel in response. The bead-assays discussed here are expected to help explain the role of remodeling in cellular adaptation to environmental stressors.
Abstract
The role of flagellar motors in bacterial motility and chemotaxis is well-understood. Recent discoveries suggest that flagellar motors are able to remodel in response to a variety of environmental stimuli and are among the triggers for surface colonization and infections. The precise mechanisms by which motors remodel and promote cellular adaptation likely depend on key motor attributes. The photomultiplier-based bead-tracking technique presented here enables accurate biophysical characterization of motor functions, including adaptations in motor speeds and switch-dynamics. This approach offers the advantage of real-time tracking and the ability to probe motor behavior over extended durations. The protocols discussed can be readily extended to study flagellar motors in a variety of bacterial species.
Introduction
Flagellaire motoren in staat cellen te zwemmen door roterende spiraalvormige extracellulaire filamenten. De hoeveelheid koppel van de motor kan genereren voor een bepaalde lengte van het flagellum (dat wil zeggen, de viskeuze belasting) bepaalt het zwemmen snelheden. Anderzijds, zijn vermogen om de draairichting schakelaar regelt celmigratie als reactie op chemische stoffen, een proces dat bekend staat als chemotaxis. Chemotaxis en beweeglijkheid zijn virulentiefactoren 1-3, flagellaire motoren zijn goed gekarakteriseerd door de jaren heen 4. Toenemende bewijs nu dat de motor werkt als een mechanosensor – het mechanisch detecteert de aanwezigheid van vaste substraten 5,6. Dit vermogen waarschijnlijk helpt bij het ontstaan oppervlaktekolonisatie en infecties 5,7. Hierdoor mechanismen waardoor de motor detecteert oppervlakken en ingewijden signalering significantieniveau 8,9.
De flagellaire motor kan gemakkelijk worden bestudeerd door tethering de flagellum op een substraat en waarnemen cel rotatie. Dergelijke tethering werd eerst bereikt door Silverman en Simon, die met een polyhook mutant in E. coli en succesvol verbonden haken glassubstraten met anti-haak antilichamen 10 werkte. De gebonden cel assay konden de onderzoekers de antwoorden van de motor-schakelaar bestuderen van verschillende chemische stimuli. Bijvoorbeeld, Segall en collega chemisch gebonden gestimuleerde cellen met behulp van iontoforetische pipetten. De overeenkomstige wijzigingen in de CW vertekening (de fractie van de tijd motoren draaien met de klok mee, CW) stelde hen in staat om de kinetiek van de aanpassing te meten in de chemotaxis netwerk 11,12. Terwijl de tethered cel assay effectief in het bestuderen switch reacties, het was alleen in staat om inzichten in motor mechanica bieden meer dan een beperkt aantal viskeuze lasten 13. Om dit probleem te overwinnen, Ryu en medewerkers aangebonden bolvormige, latex kralen stubs op cellen vast oppervlakken gloeidraad. De kralen warenvervolgens gevolgd met behulp van back-focal interferometrie met zwakke optische vallen 14. Door te werken met kralen van verschillende afmetingen, kunnen onderzoekers de motor te bestuderen over een veel breder scala van lasten. Deze test werd later verbeterd door Yuan en Berg, die een fotovermenigvuldiger-gebaseerde bead-tracking-techniek in combinatie met laser donkerveld belichting ontwikkeld. Hun methode mogelijk volgen van tethered goud nanobeads die zo klein waren (~ 60 nm) dat de externe viskeuze weerstanden waren lager in vergelijking met de interne weerstanden viskeuze rotatie 15,16. Dit leidde tot de metingen van de maximaal haalbare snelheid in E. coli (~ 300 Hz). In V. alginolyticus, soortgelijke kralen assays mogelijk metingen van de spinnen tarieven op tussenliggende viskeuze belasting (~ 700 Hz) 17. Door het inschakelen van de metingen van motorische reacties over het gehele mogelijke waaier van viskeuze lasten (van nul-belasting op near-stal), de kraal-assays mits een belangrijk biofysische hulpmiddel om te begrijpen van de torque generatie proces 18,19.
Onlangs, bewerkt we de Yuan-Berg assay optische pincetten die ons in staat om precieze mechanische stimuli van toepassing op individuele motors 6 omvatten. Met deze techniek hebben we aangetoond dat de kracht-generators de motor draaien dynamisch mechanosensors – ze verbouwen in reactie op veranderingen in viskeuze belastingen. Het is mogelijk dat dergelijke load-sensing triggers celdifferentiatie in zwermen bacteriën, hoewel de mechanismen onduidelijk. Het is ook waarschijnlijk dat de flagellar motoren van andere species zijn ook mechanosensitieve 20, ofschoon direct bewijs ontbreekt. Hier bespreken we de fotovermenigvuldiger-gebaseerde (PMT) benadering voor het volgen van de rotatie van latex bolletjes gebonden aan flagellaire filamenten 15. In vergelijking met het volgen van ultrasnelle camera, de fotovermenigvuldiger-opstelling is voordelig omdat het relatief eenvoudig om één kralen in real time en over lange duragen. Het is vooral handig bij het bestuderen van de lange tijd remodeling in flagellaire motor complexen te wijten aan prikkels uit de omgeving 21. Hoewel we detail protocollen specifiek voor E. coli, kunnen zij gemakkelijk worden aangepast voor het bestuderen flagellaire motoren in andere soorten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Om vastgebonden kraal-tracking en correcte inschatting van de motor-koppels te vergemakkelijken, dient de volgende gegevens te worden beoordeeld. Bij het uitvoeren van deze metingen met gegeseld cellen, scheren is een cruciale stap. Shearing vermindert de flagellaire filament tot slechts stomp, waardoor wordt gewaarborgd dat de viskeuze belasting van de motor is hoofdzakelijk te wijten aan de korrel en kan worden geschat op 10% fout 16. Shearing verbetert ook de kans op het vinden van cirkelvormige trajecten …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge Howard Berg for the gift of the bead-tracking microscope/photomultipliers and the Texas A&M Engineering Experiment Station for funds.
Materials
| Poly-L-lysine Solution (0.1%) | Sigma-Aldrich | P8920 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US |
| Polybead Microspheres | Polysciences, Inc. | 7307 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US |
| 1 ml Luer Slip Tip Syringe | Exel Int. | 26048 | http://www.exelint.com/tuberculin_syringes.php |
| Clay Adams Intramedic Luer-Stub Adapter 23-gauge | Becton, Dickinson and Company | 427565 | http://www.bd.com/ds/productCenter/ES-LuerStubAdaptors.asp |
| Polyethylene tubing | Harvard Apparatus | 59-8325 | http://www.harvardapparatus.com/laboratory-polye-polyethylene-non-sterile-tubing.html |
| Photomultiplier Tubes | Hamamatsu | R7400U-20 | Spectral response range of 300 to 920 nm, Peak wavelength 630 nm, 0.78 ns response time http://pdf1.alldatasheet.com/datasheet-pdf/view/212308/HAMAMATSU/R7400U-20.html |
| 3×1 mm precision slits | Edmund Optics | NT39-908 | 2 slits mounted at right angles to one another on photomultiplier tubes |
| Oscilloscope | Tektronix | TBS 1032B | Alternative brands are acceptable. Digital Oscilloscope, TBS 1000B Series, 2 Analogue, 30 MHz, 500 MSPS, 2.5 kpts http://www.tek.com/oscilloscope/tbs1000b-digital-storage-oscilloscope |
| 8 Pole LP/HP Filter | Krohn-Hite | 3384 | Alternative brands are acceptable. A frequency range from 0.1 Hz to 200 kHz is recommended. http://www.krohn-hite.com/htm/filters/PDF/3384Data.pdf |
| Optiphot microscope | Nikon | NA | Any upright or inverted phase microscope can be used. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=754 |
| 50:50 (R:T) Cube Beamsplitter | ThorLabs | BS013 |
Riferimenti
- Emody, L., Kerenyi, M., Nagy, G. Virulence factors of uropathogenic Echerichia coli. Int J Antimicrob. Ag. 22, 29-33 (2003).
- Lane, M. C., et al. Role of motility in the colonization of uropathogenic Escherichia coli in the urinary tract. Infect Immun. 73 (11), 7644-7656 (2005).
- Kao, C. Y., et al. The complex interplay among bacterial motility and virulence factors in different Escherichia coli infections. Eur J Clin Microbiol Infect Dis. 33 (12), 2157-2162 (2014).
- Berg, H. C. The rotary motor of bacterial flagella. Annu Rev Biochem. 72, 19-54 (2003).
- McCarter, L., Hilmen, M., Silverman, M. Flagellar Dynamometer Controls Swarmer Cell Differentiation of V. parahaemolyticus. Cell. 54 (3), 345-351 (1988).
- Lele, P. P., Hosu, B. G., Berg, H. C. Dynamics of mechanosensing in the bacterial flagellar motor. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (29), 11839-11844 (2013).
- Gode-Potratz, C. J., Kustusch, R. J., Breheny, P. J., Weiss, D. S., McCarter, L. L. Surface sensing in Vibrio parahaemolyticus triggers a programme of gene expression that promotes colonization and virulence. Mol Microbiol. 79 (1), 240-263 (2011).
- Kearns, D. B. A field guide to bacterial swarming motility. Nat Rev Microbiol. 8 (9), 634-644 (2010).
- Belas, R. Biofilms, flagella, and mechanosensing of surfaces by bacteria. Trends Microbiol. 22 (9), 517-527 (2014).
- Silverman, M., Simon, M. Flagellar rotation and the mechanism of bacterial motility. Nature. 249, 73-74 (1974).
- Block, S. M., Segall, J. E., Berg, H. C. Adaptation Kinetics in Bacterial Chemotaxis. J Bacteriol. 154 (1), 312-323 (1983).
- Segall, J. E., Block, S. M., Berg, H. C. Temporal comparisons in bacterial chemotaxis. Proc Natl Acad Sci U S A. 83, 8987-8991 (1986).
- Blair, D. F., Berg, H. C. Restoration of torque in defective flagellar motors. Science. 242 (4886), 1678-1681 (1988).
- Ryu, W. S., Berry, R. M., Berg, H. C. Torque-generating units of the flagellar motor of Escherchia coli have a high duty ratio. Nature. 403, 444-447 (2000).
- Yuan, J., Berg, H. C. Resurrection of the flagellar rotary motor near zero load. Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (4), 1182-1185 (2008).
- Yuan, J., Fahrner, K. A., Berg, H. C. Switching of the bacterial flagellar motor near zero load. J Mol Biol. 390 (3), 394-400 (2009).
- Sowa, Y., Hotta, H., Homma, M., Ishijima, A. Torque-speed Relationship of the Na+-driven Flagellar Motor of Vibrio alginolyticus. J Mol Biol. 327 (5), 1043-1051 (2003).
- Xing, J., Bai, F., Berry, R., Oster, G. Torque-speed relationship of the bacterial flagellar motor. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (5), 1260-1265 (2006).
- Meacci, G., Tu, Y. Dynamics of the bacterial flagellar motor with multiple stators. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (10), 3746-3751 (2009).
- Lele, P. P., Roland, T., Shrivastava, A., Chen, Y. H., Berg, H. C. The flagellar motor of Caulobacter crescentus generates more torque when a cell swims backwards. Nat Phys. 12 (2), 175-178 (2016).
- Lele, P. P., Shrivastava, A., Roland, T., Berg, H. C. Response thresholds in bacterial chemotaxis. Sci Adv. 1 (9), e1500299 (2015).
- Berg, H. C., Turner, L. Torque Generated by the Flagellar Motor of Escherichia coli. Biophys J. 65, 2201-2216 (1993).
- Bai, F., et al. Conformational Spread as a Mechanism for Cooperativity in the Bacterial Flagellar Switch. Science. 327, 685-689 (2010).
- Reid, S. W., et al. The maximum number of torque-generating units in the flagellar motor of Escherichia coli is at least 11. Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 8066-8071 (2006).
- Chen, X., Berg, H. C. Torque-Speed Relationship of the Flagellar Rotary Motor of Escherichia coli. Biophys J. 78, 1036-1041 (2000).
- Turner, L., Caplan, S. R., Berg, H. C. Temperature-induced switching of the bacterial flagellar motor. Biophys J. 71, 2227-2233 (1996).
