べん毛モーターの機能の生物物理学的特性評価
Summary
Recent findings suggest that bacterial flagellar motors sense a variety of environmental signals and remodel in response. The bead-assays discussed here are expected to help explain the role of remodeling in cellular adaptation to environmental stressors.
Abstract
The role of flagellar motors in bacterial motility and chemotaxis is well-understood. Recent discoveries suggest that flagellar motors are able to remodel in response to a variety of environmental stimuli and are among the triggers for surface colonization and infections. The precise mechanisms by which motors remodel and promote cellular adaptation likely depend on key motor attributes. The photomultiplier-based bead-tracking technique presented here enables accurate biophysical characterization of motor functions, including adaptations in motor speeds and switch-dynamics. This approach offers the advantage of real-time tracking and the ability to probe motor behavior over extended durations. The protocols discussed can be readily extended to study flagellar motors in a variety of bacterial species.
Introduction
べん毛モーターは、らせん状の細胞外フィラメントを回転させることで泳ぐために細胞を可能にします。モーターは、鞭毛（ すなわち 、粘性負荷）の所定の長さのために生成することができるトルクの量は、遊泳速度を決定します。一方、回転方向を切り替える能力は、化学物質、走化性として知られるプロセスに応じて細胞移動を制御します。走化性及び運動性ある毒性が1-3因子 、鞭毛モーターは年4上で十分に特徴づけされています。証拠は今、モータがメカノとして作用することを示唆している-それは機械的に固体基板5,6の存在を検出します。この能力は、おそらく表面のコロニー形成および感染症5,7を誘発するのに役立ちます。その結果、モータが表面を検知し、シグナル伝達を開始させるメカニズムが有意8,9です。
べん毛モーターは容易にflagellを係留することによって研究することができますumの基板へとセルの回転を観察します。このようなテザリングは、最初の10の抗フック抗体を用いてガラス基板に大腸菌 、正常に取り付けられたフックにpolyhook変異体で働いていたシルバーとサイモン、によって達成されました。係留細胞アッセイは、化学的刺激の様々なモーター・スイッチの応答を研究する研究者を可能にしました。例えば、セガルおよび共同研究者は、化学的イオン導入ピペットを用いてテザー細胞を刺激しました。 CW バイアスの対応する変化（モータは、CWを時計回りに回す時間の割合）は、走化性ネットワーク11,12に適応の動態を測定するためにそれらを可能にしました。係留細胞アッセイは、スイッチの応答を研究する上で有効であったが、唯一の粘性負荷13の限られた範囲にわたって運動力学への洞察を提供することができました。この問題を克服するために、リュおよび共同研究者は、表面に付着した細胞上のフィラメントスタブに球状、ラテックスビーズを係留しました。ビーズがありましたその後、弱い光トラップ14で逆焦点干渉計を使用して追跡。異なるサイズのビーズと協力して、研究者は、負荷のより広い範囲に渡ってモーターを学ぶことができます。このアッセイは、後にレーザー暗視野照明と組み合わせた光電子増倍管ベースのビーズ追跡技術を開発した元とベルク、改善されました。彼らの方法は、外部の粘性抵抗が回転15,16の内部の粘性抵抗に比べて低かったこと（〜60 nm）のように小さなました係留金ナノビーズの追跡を可能にしました。これは、 大腸菌 （〜300ヘルツ）で達成可能な最大速度の測定値につながりました。 V.のalginolyticusでは、同様のビーズアッセイは、中間粘性負荷（〜700 Hz）で17で回転速度の測定を可能にしました。 （無負荷から近いストールに）粘性負荷の全体の可能な範囲での運動反応の測定を可能にすることにより、ビーズアッセイは、トンを理解するための重要な生物物理学的なツールを提供しました可トルク世代のプロセス18,19。
最近、我々は個々のモータ6に精密な機械的刺激を適用することができた光ピンセットを含むように元-Bergのアッセイを修正しました。それらは粘性負荷の変化に応じて改造 – この手法を用いて、モータの回転力発生器が動的mechanosensorsであることを示しました。メカニズムは不明のままであるが、このような負荷感知群がっ細菌への細胞の分化をトリガすることが可能です。直接的な証拠が不足しているものの、他の種におけるべん毛モーターは、また20機械受容していることもありそうです。ここでは、鞭毛フィラメント15につながラテックスビーズの回転を追跡するための光電子増倍管ベース（PMT）のアプローチを議論します。リアルタイムでかつ長期硬膜の上に単一のビーズを追跡することは比較的簡単であるため、超高速カメラで追跡と比較して、光電子増倍管、セットアップが有利です。ション。環境刺激21にべん毛モーター複合体で長時間の再構築を検討する場合に特に便利です。具体的には、大腸菌のための我々詳細プロトコルが、それらは、容易に他の種における鞭毛モーターを研究するために適合させることができます。
Protocol
Representative Results
Discussion
係留ビーズの追跡とモータトルクの正確な推定を容易にするために、以下の情報を見直すべきです。鞭毛細胞でこれらの測定を行う場合、剪断は重要なステップです。シャーリングにより、モータ上の粘性負荷が主にビーズによるものであり、10％の誤差16内に推定することができることを確認して、単なるスタブにべん毛フィラメントを低減します。シャーリングもしっかりと分散?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge Howard Berg for the gift of the bead-tracking microscope/photomultipliers and the Texas A&M Engineering Experiment Station for funds.
Materials
| Poly-L-lysine Solution (0.1%) | Sigma-Aldrich | P8920 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US |
| Polybead Microspheres | Polysciences, Inc. | 7307 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US |
| 1 ml Luer Slip Tip Syringe | Exel Int. | 26048 | http://www.exelint.com/tuberculin_syringes.php |
| Clay Adams Intramedic Luer-Stub Adapter 23-gauge | Becton, Dickinson and Company | 427565 | http://www.bd.com/ds/productCenter/ES-LuerStubAdaptors.asp |
| Polyethylene tubing | Harvard Apparatus | 59-8325 | http://www.harvardapparatus.com/laboratory-polye-polyethylene-non-sterile-tubing.html |
| Photomultiplier Tubes | Hamamatsu | R7400U-20 | Spectral response range of 300 to 920 nm, Peak wavelength 630 nm, 0.78 ns response time http://pdf1.alldatasheet.com/datasheet-pdf/view/212308/HAMAMATSU/R7400U-20.html |
| 3×1 mm precision slits | Edmund Optics | NT39-908 | 2 slits mounted at right angles to one another on photomultiplier tubes |
| Oscilloscope | Tektronix | TBS 1032B | Alternative brands are acceptable. Digital Oscilloscope, TBS 1000B Series, 2 Analogue, 30 MHz, 500 MSPS, 2.5 kpts http://www.tek.com/oscilloscope/tbs1000b-digital-storage-oscilloscope |
| 8 Pole LP/HP Filter | Krohn-Hite | 3384 | Alternative brands are acceptable. A frequency range from 0.1 Hz to 200 kHz is recommended. http://www.krohn-hite.com/htm/filters/PDF/3384Data.pdf |
| Optiphot microscope | Nikon | NA | Any upright or inverted phase microscope can be used. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=754 |
| 50:50 (R:T) Cube Beamsplitter | ThorLabs | BS013 |
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