Flagellar मोटर कार्यों की biophysical विशेषता
Summary
Recent findings suggest that bacterial flagellar motors sense a variety of environmental signals and remodel in response. The bead-assays discussed here are expected to help explain the role of remodeling in cellular adaptation to environmental stressors.
Abstract
The role of flagellar motors in bacterial motility and chemotaxis is well-understood. Recent discoveries suggest that flagellar motors are able to remodel in response to a variety of environmental stimuli and are among the triggers for surface colonization and infections. The precise mechanisms by which motors remodel and promote cellular adaptation likely depend on key motor attributes. The photomultiplier-based bead-tracking technique presented here enables accurate biophysical characterization of motor functions, including adaptations in motor speeds and switch-dynamics. This approach offers the advantage of real-time tracking and the ability to probe motor behavior over extended durations. The protocols discussed can be readily extended to study flagellar motors in a variety of bacterial species.
Introduction
Flagellar मोटर्स पेचदार बाह्य तंतु घूर्णन द्वारा तैरने के लिए कोशिकाओं को सक्रिय करें। टोक़ की राशि मोटर कशाभिका (यानी, चिपचिपा लोड) का एक दिया अवधि के लिए उत्पन्न कर सकते हैं तैराकी गति निर्धारित करता है। दूसरी ओर, रोटेशन की दिशा में स्विच करने की क्षमता रसायन, एक प्रक्रिया chemotaxis रूप में जाना जाता है के जवाब में सेल प्रवास को नियंत्रित करता है। Chemotaxis और गतिशीलता डाह जा रहा कारकों 1-3, flagellar मोटर्स 4 वर्ष से अधिक अच्छी तरह से विशेषता की है। बढ़ते सबूत अब पता चलता है कि मोटर एक mechanosensor रूप में कार्य करता है – यह यंत्रवत् ठोस substrates 5,6 की उपस्थिति का पता लगाता है। इस क्षमता की संभावना सतह उपनिवेशवाद और संक्रमण 5.7 ट्रिगर में मदद करता है। नतीजतन, तंत्र जिससे मोटर होश सतहों और शुरू संकेतन महत्व 8,9 के हैं।
कशाभ मोटर आसानी से flagell tethering द्वारा अध्ययन किया जा सकता हैउम एक सब्सट्रेट करने के लिए और सेल रोटेशन देख। इस तरह के टेदरिंग पहले सिल्वरमैन और शमौन, जो विरोधी हुक एंटीबॉडी 10 के साथ ई कोलाई में एक polyhook उत्परिवर्ती और कांच substrates के लिए सफलतापूर्वक जुड़ी हुक के साथ काम करके हासिल की थी। सीमित सेल परख सक्षम शोधकर्ताओं ने रासायनिक उत्तेजनाओं की एक किस्म के लिए मोटर का स्विच की प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए। उदाहरण के लिए, Segall और सह कार्यकर्ताओं रासायनिक iontophoretic pipettes की सहायता के साथ सीमित कोशिकाओं को प्रेरित किया। सीडब्ल्यू पूर्वाग्रह में इसी परिवर्तन के लिए उन्हें सक्षम chemotaxis नेटवर्क 11,12 में अनुकूलन के कैनेटीक्स को मापने के लिए (समय मोटर्स के अंश का दक्षिणावर्त, सीडब्ल्यू स्पिन)। जबकि सीमित सेल परख स्विच प्रतिक्रियाओं का अध्ययन करने में प्रभावी था, यह केवल चिपचिपा भार 13 की एक सीमित रेंज पर मोटर यांत्रिकी में अंतर्दृष्टि की पेशकश करने में सक्षम था। इस समस्या को दूर करने के लिए, रयु और सह कार्यकर्ताओं सतहों के लिए अटक कोशिकाओं पर स्टब्स फिलामेंट के लिए गोलाकार, लेटेक्स मोती सीमित। मोती थेतो कमजोर ऑप्टिकल जाल 14 के साथ वापस फोकल इंटरफेरोमेट्री का उपयोग कर लगाया। विभिन्न आकार के मोतियों के साथ काम करके, शोधकर्ताओं भार का एक बहुत व्यापक रेंज पर मोटर अध्ययन कर सकता है। इस परख बाद में युआन और बर्ग, जो एक photomultiplier आधारित मनका-ट्रैकिंग लेजर अंधेरे क्षेत्र रोशनी के साथ संयुक्त रूप से विकसित तकनीक से सुधार हुआ है। सीमित सोने nanobeads कि इतने छोटे थे (~ 60 एनएम) है कि बाहरी चिपचिपा प्रतिरोध रोटेशन 15,16 करने के लिए आंतरिक चिपचिपा प्रतिरोध की तुलना में कम थे की उनकी पद्धति सक्षम ट्रैकिंग। यह ई कोलाई में अधिकतम प्राप्त गति (~ 300 हर्ट्ज) की माप के लिए नेतृत्व किया। वी alginolyticus में, इसी तरह मनका assays के मध्यवर्ती चिपचिपा भार (~ 700 हर्ट्ज) 17 में सक्षम कताई दरों की माप। (शून्य लोड से पास-स्टाल के लिए) चिपचिपा भार के पूरे संभव सीमा से अधिक मोटर प्रतिक्रियाओं की माप सक्षम करके, मनका assays टी समझने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण प्रदान की biophysicalorque पीढ़ी प्रक्रिया 18,19।
हाल ही में, हम युआन-बर्ग परख संशोधित ऑप्टिकल चिमटी हमें सक्षम है कि व्यक्ति की मोटरों से 6 सटीक यांत्रिक उत्तेजनाओं लागू करने के लिए शामिल करने के लिए। इस तकनीक का उपयोग करना, हम पता चला कि बल-जनरेटर है कि मोटर बारी बारी से गतिशील mechanosensors हैं – वे चिपचिपा भार में बदलाव के जवाब में फिर से तैयार करना। ऐसा नहीं है कि इस तरह के लोड संवेदन रेंगनेवाले बैक्टीरिया में सेल भेदभाव से चलाता है, हालांकि तंत्र अस्पष्ट रहते संभव है। यह भी संभावना है कि अन्य प्रजातियों में flagellar मोटर्स हालांकि प्रत्यक्ष सबूत की कमी है, mechanosensitive 20 भी कर रहे हैं। यहाँ, हम कशाभ तंतु 15 के लिए सीमित लेटेक्स मोतियों की रोटेशन पर नज़र रखने के लिए photomultiplier आधारित (पीएमटी) दृष्टिकोण पर चर्चा की। ultrafast कैमरों के साथ ट्रैकिंग की तुलना में, photomultiplier-सेटअप फायदेमंद है क्योंकि यह अपेक्षाकृत वास्तविक समय में और लंबे ड्यूरा अधिक एकल मोती ट्रैक करने के लिए सीधा हैमाहौल। यह विशेष रूप से उपयोगी है जब पर्यावरण उत्तेजनाओं 21 के कारण लंबे समय कशाभ मोटर परिसरों में remodeling का अध्ययन कर रहा है। हालांकि हम विस्तार से विशेष ई कोलाई के लिए प्रोटोकॉल, वे आसानी से अन्य प्रजातियों में flagellar मोटर्स के अध्ययन के लिए अनुकूलित किया जा सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
आदेश सीमित मनका-ट्रैकिंग और मोटर-torques का सही आकलन की सुविधा के लिए, निम्न जानकारी की समीक्षा की जानी चाहिए। जब flagellated कोशिकाओं के साथ इन माप प्रदर्शन, बाल काटना एक महत्वपूर्ण कदम है। बाल काटना जिससे यह सुनि?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors acknowledge Howard Berg for the gift of the bead-tracking microscope/photomultipliers and the Texas A&M Engineering Experiment Station for funds.
Materials
| Poly-L-lysine Solution (0.1%) | Sigma-Aldrich | P8920 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US |
| Polybead Microspheres | Polysciences, Inc. | 7307 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p8920?lang=en®ion=US |
| 1 ml Luer Slip Tip Syringe | Exel Int. | 26048 | http://www.exelint.com/tuberculin_syringes.php |
| Clay Adams Intramedic Luer-Stub Adapter 23-gauge | Becton, Dickinson and Company | 427565 | http://www.bd.com/ds/productCenter/ES-LuerStubAdaptors.asp |
| Polyethylene tubing | Harvard Apparatus | 59-8325 | http://www.harvardapparatus.com/laboratory-polye-polyethylene-non-sterile-tubing.html |
| Photomultiplier Tubes | Hamamatsu | R7400U-20 | Spectral response range of 300 to 920 nm, Peak wavelength 630 nm, 0.78 ns response time http://pdf1.alldatasheet.com/datasheet-pdf/view/212308/HAMAMATSU/R7400U-20.html |
| 3×1 mm precision slits | Edmund Optics | NT39-908 | 2 slits mounted at right angles to one another on photomultiplier tubes |
| Oscilloscope | Tektronix | TBS 1032B | Alternative brands are acceptable. Digital Oscilloscope, TBS 1000B Series, 2 Analogue, 30 MHz, 500 MSPS, 2.5 kpts http://www.tek.com/oscilloscope/tbs1000b-digital-storage-oscilloscope |
| 8 Pole LP/HP Filter | Krohn-Hite | 3384 | Alternative brands are acceptable. A frequency range from 0.1 Hz to 200 kHz is recommended. http://www.krohn-hite.com/htm/filters/PDF/3384Data.pdf |
| Optiphot microscope | Nikon | NA | Any upright or inverted phase microscope can be used. https://www.thorlabs.com/newgrouppage9.cfm?objectgroup_id=754 |
| 50:50 (R:T) Cube Beamsplitter | ThorLabs | BS013 |
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