Analyse af kromosomsegregation, histonacetylering og spindelmorfologi i hesteococytter
Summary
Dette manuskript beskriver en eksperimentel tilgang til morfologisk og biokemisk karakterisering af hesteocyter. Specifikt illustrerer det foreliggende arbejde, hvordan man opsamler umodne og modne hesteocyter ved hjælp af ultralydstyret ægoptagelse (OPU) og hvordan man undersøger kromosomsegregation, spindelmorfologi, global histonacetylering og mRNA-ekspression.
Abstract
Området for assisteret reproduktion er udviklet til behandling af infertilitet hos kvinder, ledsagere og truede arter. I hesten tillader assisteret reproduktion også produktion af embryoner fra højtydende uden at afbryde deres sports karriere og bidrager til en stigning i antallet af føl fra marer af høj genetisk værdi. Det nuværende manuskript beskriver de procedurer, der anvendes til at indsamle umodne og modne oocytter fra hestevacci ved anvendelse af ægoptagelse (OPU). Disse oocytter blev derefter brugt til at undersøge forekomsten af aneuploidi ved at tilpasse en protokol, der tidligere var udviklet hos mus. Specifikt blev kromosomer og centromerer af metafase II (MII) oocytter mærket fluorescens og talt på sekventielle fokalplaner efter konfokal lasermikroskop scanning. Denne analyse afslørede en højere forekomst i aneuploiditetsfrekvensen, når umodne oocytter blev opsamlet fra folliklerne og modnet in vitro i forhold tilIn vivo. Immunostaining for tubulin og den acetylerede form af histon 4 ved specifikke lysinrester afslørede også forskelle i den meotiske spindels morfologi og i det globale mønster af histonacylering. Endelig blev ekspression af mRNA'er kodende for histon-deacetylaser (HDAC'er) og acetyltransferaser (HAT'er) undersøgt ved revers transkription og kvantitativ-PCR (q-PCR). Ingen forskelle i det relative ekspression af transkripter blev observeret mellem in vitro og in vivo modnede oocytter. I overensstemmelse med en generel afstødning af transkriptionsaktiviteten under oocytmodning kan analysen af det totale transkriptionsbeløb kun afsløre mRNA-stabilitet eller nedbrydning. Disse resultater viser derfor, at andre oversættelses- og posttranslationelle bestemmelser kan påvirkes.
Samlet set beskriver den foreliggende undersøgelse en eksperimentel tilgang til morfologisk og biokemisk karakterisering af hesteocyten, en ceLl type, der er ekstremt udfordrende at studere på grund af lav sample tilgængelighed. Det kan dog udvide vores viden om reproduktiv biologi og infertilitet hos monovulatoriske arter.
Introduction
En bred vifte af assisterede reproduktionsteknikker er blevet udviklet til behandling af infertilitet hos kvinder, ledsagere og truede arter. En af de mest almindelige procedurer i kliniske indstillinger er hentning af metafase II (MII) -stadieocytter fra ovariefolliklerne ved ultralydstyret transvaginal aspiration, opsamling af æg (OPU) 1 . Disse oocytter befrugtes derefter in vitro (IVF), med det resulterende embryo (er) implanteret i en recipient uterus. MII-stadie (modne) oocytter hentes efter administration af eksogene gonadotropiner. Denne behandling er imidlertid forbundet, hos nogle patienter, med udviklingen af ovarie hyperstimulationssyndrom (OHSS) 2 .
At drage fordel af den egentlige evne hos fuldt dyrkede, umodne oocytter (GV-stadium) til spontant at genoptage meioser, når de er isoleret fra deres follikler, er det muligt at opnå modne oocytter uden administrationGonadotropin 3 . Denne procedure kaldes oocyt in vitro modning (IVM) og repræsenterer en mindre lægemiddelorienteret, billigere og mere patientvenlig tilgang til assisteret reproduktiv teknologi. Succesen med embryonudvikling med in vitro- modnede oocytter er imidlertid generelt lavere end hos in vivo modnede oocytter 4 , 5 . En mulig forklaring er, at in vitro- modnede oocytter påvirkes mere af fejl i kromosomsegregation, og den resulterende aneuploidi nedsætter normal embryonal udvikling 6 .
Forståelse af det molekylære grundlag for kromosom mis-segregering under IVM vil i sidste ende afsløre det fulde potentiale ved denne teknik. I denne vene anvendte den eksperimentelle tilgang til at undersøge de morfologiske og biokemiske egenskaber hos in vitro- modnede oocytter sammenlignet med in vivo modEd oocytter er her beskrevet 7 , 8 . Specifikt er procedurerne for OPU af umodne og modne oocytter og IVM af umodne oocytter illustreret under anvendelse af voksne og naturligt cykliske heste som en eksperimentel model. Derefter anvendes immunofluorescens og billedanalyse til at undersøge chromosomsegregation, spindelmorfologi og det globale mønster af histonacylering på disse gameter. Endelig beskrives en protokol for revers-transkription og kvantitativ PCR til analyse af mRNA-ekspression.
Sammenlignet med gnaverdyrmodeller tillader heste ikke genetisk manipulation, er det mindre let at manipulere og kræver dyr vedligeholdelse. Denne model får imidlertid stor interesse for undersøgelsen af oocytmodning 9 , 10 på grund af ligheden med menneskelig ovariefysiologi 11 , 12 </ Sup>. Desuden har udviklingen af pålidelige protokoller af IVM-IVF i hesten en væsentlig økonomisk interesse, da det ville muliggøre en forøgelse af antallet af føl fra marer af høj genetisk værdi.
En af begrænsningerne ved at udføre forsøg på oocytter, især i monovulatoriske arter, er den begrænsede prøve tilgængelighed. Denne grænse er blevet overvundet her ved at justere en fremgangsmåde, der tidligere er udviklet i mus, til hesteocyter 13 , 14 for at udføre kromosometælling, der minimerer prøveforløbet (se diskussionen for en sammenligning med andre tilgængelige teknikker). Desuden er en triple-fluorescensfarvningsprotokol optimeret til at udføre flere analyser på den samme prøve, og q-PCR-analyser blev kun udført på puljer med kun 2 oocytter.
Samlet set beskriver den foreliggende undersøgelse en eksperimentel tilgang, der har til formål at morfologisk og biokemisk chaRacterize hest oocyt, en celletype, der er ekstremt udfordrende at studere på grund af den lave prøve tilgængelighed. Det kan dog udvide vores viden om reproduktiv biologi og infertilitet hos monovulatoriske arter.
Protocol
Representative Results
Discussion
Selv om IVM er blevet udført på heste i mere end 20 år 16 , ved vi endnu ikke, om oocyten kan være oprindelsen af embryonal aneuploidi, som det er blevet foreslået for mennesker 17 . Årsagen er sandsynligvis, at fremstillingen af oocyt-spredninger til kromosometælling resulterer i et betydeligt prøveab. Med dette i betragtning blev en undersøgelse af metoderne til undersøgelse af fejl i kromosomsegregation udført for at søge den mest hensigtsmæssig…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne vil gerne takke Fabrice Vincent for supporten med laser scanning confocal microscopy (LSCM) , og Philippe Barrière og Thierry Blard for at udføre daglig ultralyd ovariescanning og hCG-injektion. Dette arbejde blev delvist støttet af "Regione Sardegna og Regione Lombardia" -projektet "Ex Ovo Omnia" (tilskud nr. 26096200 til AML); "L'Oreal Italia per le Donne e la Scienza 2012" fællesskab (kontrakt 2012 til FF), FP7-PEOPLE-2011- CIG, forskningsforvaltningsorganet (REA) "Pro-Ovum" (tilskud nr. 303640 til VL); Og af Postdoktorskolen for Landbrug og Veterinærmedicin, medfinansieret af Den Europæiske Socialfond, Sektorielt Operationelt Program for Menneskelige Ressourceudvikling 2007-2013 (Kontrakt nr. POSDRU / 89 / 1.5 / S / 62371 til IM). In vivo- oocytopsamlingen blev finansieret af Institut Français du Cheval et de l'Equitation.
Materials
| ultrasound probe | Aloka | UST-5820-7,5 | |
| human chorionic gonadotrophin | centravet | CHO004 | 1500unit/animal IV |
| detomidine | centravet | MED010 | 9-15µg/kg IV |
| butylscopolamine bromure | centravet | EST001 | 0,2mg/kg IV |
| stereomicroscope | NIKON | SMZ-2B | |
| butorphanol | centravet | DOL003 | 10µg/kg IV |
| benzyl-penicillin | centravet | DEP203 IM | 15000UI/animal |
| TCM199 | Sigma-Aldrich | M3769 10X1L | powder for hepes-buffered TCM199 |
| Hepes sodium salt | Sigma-Aldrich | H3784-100G | |
| bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A8806 | |
| heparin | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
| NaHCO3-buffered TCM199 | Sigma-Aldrich | M2154-500ML | liquid for IVM medium |
| epidermal growth factor | Sigma-Aldrich | E4127 | |
| newborn calf serum | Sigma-Aldrich | N4762-500ML | |
| 4-well dishes | NUNCLON | 144444 | |
| incubator | Heraeus | BB6060 | |
| monastrol | Sigma-Aldrich | M8515 | |
| hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3506 | |
| pronase | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| polyvinyl alcohol | Sigma-Aldrich | 341584 | |
| triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| normal donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| rabbit anti-Aurora B phospho-Thr232 | BioLegend | 636102 | |
| TRITC-conjugated donkey anti-rabbit IgG | Vector Laboratories | 711-025-152 | |
| Vecta-Shield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| YOPRO1 | Thermofisher Scientific | Y3603 | |
| confocal laser scanning microscope | LSM 780 | Zeiss | |
| confocal laser scanning microscope | LSM 700 | Zeiss | |
| ImageJ software | rsb.info. nih.gov/ij/download.html | free resource | |
| mouse anti-alpha-tubulin | Sigma-Aldrich | T8203 | |
| rabbit anti-acH4K16 | Upstate Biotechnology | 07-329 | |
| AlexaFluor 488-coniugated donkey anti-mouse IgG | Life Technologies | A21202 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole | Sigma-Aldrich | D8417 | DAPI |
| centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| RNALater | Invitrogen | AM7020 | |
| Luciferase RNA | Promega | L4561 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | 12204-01 | |
| random hexamers | Thermofisher Scientific | N8080127 | |
| mouse Moloney leukaemia virus reverse transcriptase | Thermofisher Scientific | 28025013 | |
| SYBR green supermix | BioRad | 1708880 | |
| specific primers | Sigma-Aldrich | specific primers were designed using Primer3Plus software (free resource) | |
| thermal-cycler | BioRad | MyiQ | |
| mouse monoclonal anti-CENPA | Abcam | ab13939 | |
| mouse monoclonal anti-Aurora B | Abcam | ab3609 | |
Riferimenti
- Dellenbach, P. Transvaginal, sonographically controlled ovarian follicle puncture for egg retrieval. Lancet. 1 (8392), 1467 (1984).
- Humaidan, P. Ovarian hyperstimulation syndrome: review and new classification criteria for reporting in clinical trials. Hum Reprod. , (2016).
- Pincus, G., Enzmann, E. V. The Comparative Behavior of Mammalian Eggs in Vivo and in Vitro : I. The Activation of Ovarian Eggs. J Exp Med. 62 (5), 665-675 (1935).
- Emery, B. R., Wilcox, A. L., Aoki, V. W., Peterson, C. M., Carrell, D. T. In vitro oocyte maturation and subsequent delayed fertilization is associated with increased embryo aneuploidy. Fertil Steril. 84 (4), 1027-1029 (2005).
- Nichols, S. M., Gierbolini, L., Gonzalez-Martinez, J. A., Bavister, B. D. Effects of in vitro maturation and age on oocyte quality in the rhesus macaque Macaca mulatta. Fertil Steril. 93 (5), 1591-1600 (2010).
- Requena, A. The impact of in-vitro maturation of oocytes on aneuploidy rate. Reprod Biomed Online. 18 (6), 777-783 (2009).
- Franciosi, F. In vitro maturation affects chromosome segregation, spindle morphology and acetylation of lysine 16 on histone H4 in horse oocytes. Reprod Fertil Dev. , (2015).
- Franciosi, F. Changes in histone H4 acetylation during in vivo versus in vitro maturation of equine oocytes. Mol Hum Reprod. 18 (5), 243-252 (2012).
- Choi, Y. H., Gibbons, J. R., Canesin, H. S., Hinrichs, K. Effect of medium variations (zinc supplementation during oocyte maturation, perifertilization pH, and embryo culture protein source) on equine embryo development after intracytoplasmic sperm injection. Theriogenology. , (2016).
- Hendriks, W. K. Maternal age and in vitro culture affect mitochondrial number and function in equine oocytes and embryos. Reprod Fertil Dev. 27 (6), 957-968 (2015).
- Carnevale, E. M. The mare model for follicular maturation and reproductive aging in the woman. Theriogenology. 69 (1), 23-30 (2008).
- Ginther, O. J. The mare: a 1000-pound guinea pig for study of the ovulatory follicular wave in women. Theriogenology. 77 (5), 818-828 (2012).
- Chiang, T., Duncan, F. E., Schindler, K., Schultz, R. M., Lampson, M. A. Evidence that weakened centromere cohesion is a leading cause of age-related aneuploidy in oocytes. Curr Biol. 20 (17), 1522-1528 (2010).
- Duncan, F. E., Chiang, T., Schultz, R. M., Lampson, M. A. Evidence that a defective spindle assembly checkpoint is not the primary cause of maternal age-associated aneuploidy in mouse eggs. Biol Reprod. 81 (4), 768-776 (2009).
- Larionov, A., Krause, A., Miller, W. A standard curve based method for relative real time PCR data processing. BMC Bioinformatics. 6 (62), (2005).
- Choi, Y. H., Hochi, S., Braun, J., Sato, K., Oguri, N. In vitro maturation of equine oocytes collected by follicle aspiration and by the slicing of ovaries. Theriogenology. 40 (5), 959-966 (1993).
- Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
- Akiyama, T., Nagata, M., Aoki, F. Inadequate histone deacetylation during oocyte meiosis causes aneuploidy and embryo death in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (19), 7339-7344 (2006).
- Homer, H. A. Mad2 prevents aneuploidy and premature proteolysis of cyclin B and securin during meiosis I in mouse oocytes. Genes Dev. 19 (2), 202-207 (2005).
- Rambags, B. P. Numerical chromosomal abnormalities in equine embryos produced in vivo and in vitro. Mol Reprod Dev. 72 (1), 77-87 (2005).
- Nabti, I., Marangos, P., Bormann, J., Kudo, N. R., Carroll, J. Dual-mode regulation of the APC/C by CDK1 and MAPK controls meiosis I progression and fidelity. J Cell Biol. 204 (6), 891-900 (2014).
- Shomper, M., Lappa, C., FitzHarris, G. Kinetochore microtubule establishment is defective in oocytes from aged mice. Cell Cycle. 13 (7), 1171-1179 (2014).
- Luzzo, K. M. High fat diet induced developmental defects in the mouse: oocyte meiotic aneuploidy and fetal growth retardation/brain defects. PLoS One. 7 (11), e49217 (2012).
- Ma, P., Schultz, R. M. Histone deacetylase 2 (HDAC2) regulates chromosome segregation and kinetochore function via H4K16 deacetylation during oocyte maturation in mouse. PLoS Genet. 9 (3), e1003377 (2013).
- Yang, F., Baumann, C., Viveiros, M. M., De La Fuente, R. Histone hyperacetylation during meiosis interferes with large-scale chromatin remodeling, axial chromatid condensation and sister chromatid separation in the mammalian oocyte. Int J Dev Biol. 56 (10-12), 889-899 (2012).
- Luciano, A. M. Oocytes isolated from dairy cows with reduced ovarian reserve have a high frequency of aneuploidy and alterations in the localization of progesterone receptor membrane component 1 and aurora kinase B. Biol Reprod. 88 (3), 58 (2013).
- Luciano, A. M., Lodde, V., Franciosi, F., Ceciliani, F., Peluso, J. J. Progesterone receptor membrane component 1 expression and putative function in bovine oocyte maturation, fertilization, and early embryonic development. Reproduction. 140 (5), 663-672 (2010).
- Terzaghi, L. PGRMC1 participates in late events of bovine granulosa cells mitosis and oocyte meiosis. Cell Cycle. , 1-14 (2016).
- Susor, A., Jansova, D., Anger, M., Kubelka, M. Translation in the mammalian oocyte in space and time. Cell Tissue Res. 363 (1), 69-84 (2016).
- Chen, J. Genome-wide analysis of translation reveals a critical role for deleted in azoospermia-like (Dazl) at the oocyte-to-zygote transition. Genes Dev. 25 (7), 755-766 (2011).
- Ma, J., Flemr, M., Strnad, H., Svoboda, P., Schultz, R. M. Maternally recruited DCP1A and DCP2 contribute to messenger RNA degradation during oocyte maturation and genome activation in mouse. Biol Reprod. 88 (1), 11 (2013).
