क्रोमोजोम अलगाव का विश्लेषण, हिस्टोन एसिटिलेशन, और स्पिंडल मोर्फ़ोलॉजी इन हॉर्स ओक्साइट्स
Summary
यह पांडुलिपि घोड़ों के लिए एक प्रयोगात्मक दृष्टिकोण का वर्णन करता है और जैविक रूप से घोड़े के oocytes को चिह्नित करता है। विशेष रूप से, वर्तमान काम से पता चलता है कि कैसे अल्ट्रासाउंड-निर्देशित अंडा पिक-अप (ओपीयू) द्वारा अपरिपक्व और परिपक्व घोड़े oocytes को इकट्ठा किया जाता है और गुणसूत्र अलगाव, स्पिन्डल मोर्फीलाजी, ग्लोबल हिस्टोन एसिटिलेशन, और एमआरएनए अभिव्यक्ति की जांच कैसे की जाती है।
Abstract
महिलाओं, साथी जानवरों और लुप्तप्राय प्रजातियों में बांझपन के इलाज के लिए सहायता प्रजनन का क्षेत्र विकसित किया गया है। घोड़े में, सहायता प्रजनन भी अपने खेल कैरियर में दखल के बिना उच्च प्रदर्शन से भ्रूण के उत्पादन के लिए अनुमति देता है और उच्च आनुवांशिक मूल्य के mares से foals की संख्या में वृद्धि के लिए योगदान देता है। वर्तमान पांडुलिपि, अंडा पिकअप (ओपीयू) का उपयोग कर घोड़े अंडाओं से अपरिपक्व और परिपक्व ओक्साइट्स एकत्र करने के लिए इस्तेमाल की जाने वाली प्रक्रियाओं का वर्णन करता है। इन अयस्केट्स का उपयोग तब चूहों में विकसित प्रोटोकॉल को अनुकूल करके एनीप्लोइड की घटनाओं की जांच के लिए किया जाता था। विशेष रूप से, क्रोमोसोम और मेटाफेस II (एमआईआई) ओक्साइट्स के centromeres को फ्लॉओससेंटली लेबल और सिलसिलेबल लेजर माइक्रोस्कोप स्कैनिंग के बाद अनुक्रमिक फोकल योजनाओं पर गिना गया। इस विश्लेषण ने एनीप्लोओइडी दर में उच्च घटना का पता लगाया जब अपरिपक्व oocytes follicles से एकत्र किए गए थे और इन विट्रो की तुलना में परिपक्वविवो में ट्यूबिलिन के लिए इम्यूनोस्टाईन और विशिष्ट लाइसिन अवशेषों पर एसिटिलेटेड हिस्टोन चार रूपों में भी मैयियटिक स्पिंडल के आकृति विज्ञान में अंतर और हिस्टोन एसिटिलेशन के वैश्विक पैटर्न में अंतर का पता चला है। अंत में, हिस्टोन डेकेटेलीज़ (एचडीएसी) और एसीटील-ट्रांसेफेस (एचएटी) के लिए कोडिंग एमआरएनए की अभिव्यक्ति की रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन और मात्रात्मक-पीसीआर (क्यू-पीसीआर) द्वारा जांच की गई। प्रतिलिपि की रिश्तेदार अभिव्यक्ति में कोई मतभेद इन विट्रो और विवो परिपक्व ऑओसाइट्स के बीच मनाया गया था। Oocyte परिपक्वता के दौरान ट्रांसक्रिप्शनल गतिविधि के एक सामान्य चुप्पी के साथ समझौते में, कुल प्रतिलेख राशि का विश्लेषण केवल एमआरएनए स्थिरता या गिरावट को प्रकट कर सकता है। इसलिए, ये निष्कर्ष बताते हैं कि अन्य अनुवाद और पोस्ट-ट्रांसलेशन संबंधी नियमों को प्रभावित किया जा सकता है।
कुल मिलाकर, वर्तमान अध्ययन में morphologically और बायोकेमिक रूप से घोड़े oocyte, एक सीई को चिह्नित करने के लिए एक प्रयोगात्मक दृष्टिकोण का वर्णन करता हैकम नमूना उपलब्धता के कारण अध्ययन करने के लिए अत्यंत चुनौतीपूर्ण होगा। हालांकि, यह ज्ञानी प्रजातियों में प्रजनन जीव विज्ञान और बांझपन पर हमारे ज्ञान का विस्तार कर सकता है।
Introduction
महिलाओं, साथी जानवरों और लुप्तप्राय प्रजातियों में बांझपन के इलाज के लिए सहायक प्रजनन तकनीकों का एक विशाल सरणी विकसित किया गया है। क्लिनिकल सेटिंग्स में सबसे आम प्रक्रियाओं में से एक है मेटाफेस II (एमआईआई) -स्टेज oocytes को अंडाशय के follicles से अल्ट्रासाउंड-निर्देशित ट्रांसीवैगन एस्पिरेशन, डिव्वल पिक-अप (ओपीयू) 1 द्वारा पुनर्प्राप्ति। इन अयस्क्यट्स को तब इन विट्रो (आईवीएफ) में निषेचित किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप भ्रूण को प्राप्तकर्ता गर्भाशय में प्रत्यारोपित किया जाता है। एमआईआई-स्टेज (परिपक्व) oocytes एक्सोजेन्सियस गोनाडोट्रोपिन के प्रशासन के बाद प्राप्त किये जाते हैं। हालांकि, यह उपचार कुछ रोगियों में, डिम्बग्रंथि हाइपरस्टिम्यूलेशन सिंड्रोम (ओएचएसएस) 2 के विकास के साथ जुड़ा हुआ है
पूरी तरह से विकसित, अपरिपक्व oocytes (जीवी-स्टेज) की आंतरिक क्षमता का लाभ उठाते हुए एक बार अपने रोम से अलग आयोइसिस को फिर से शुरू करने के लिए, प्रशासन के बिना परिपक्व oocytes प्राप्त करना संभव हैटियरिंग गोनाडोट्रोपिन 3 इन प्रक्रियाओं को इन विट्रो परिपक्वता (आईवीएम) में ऊसाइट कहा जाता है और सहायता प्रजनन प्रौद्योगिकी के लिए कम दवा-उन्मुख, कम खर्चीली और अधिक रोगी-अनुकूल दृष्टिकोण का प्रतिनिधित्व करता है। हालांकि, इन विट्रो- मेचर्ड ऑओसाइट्स में भ्रूण के विकास की सफलता आमतौर पर विवो परिपक्व ऑओसाइट्स 4 , 5 के मुकाबले कम है। एक संभावित स्पष्टीकरण यह है कि गुणसूत्र अलगाव में त्रुटियों से इन विट्रो परिपक्व ओओसाइट्स में अधिक प्रभावित होते हैं, और जिसके परिणामस्वरूप अनयूपलोइडी सामान्य भ्रूणिक विकास 6 को प्रभावित करते हैं।
आईवीएम के दौरान क्रोमोसोमल गलत-पृथक्करण के आणविक आधार को समझना अंततः इस तकनीक की पूरी संभावना का खुलासा करेगा। इस नस में, इन विट्रो- मैक्टेरड ऑक्साईट्स में विवो मैटुर के मुकाबले तुलनात्मक रूप से आकृति विज्ञान और जैव रासायनिक विशेषताओं की जांच के लिए प्रयोगात्मक दृष्टिकोणएड oocytes यहाँ वर्णित है 7 , 8 विशेष रूप से, अपरिपक्व और परिपक्व ओक्साइट्स के ओपीयू के लिए प्रक्रियाएं और अपरिपक्व oocytes के आईवीएम को एक प्रयोगात्मक मॉडल के रूप में वयस्क और स्वाभाविक रूप से साइकिल चालन घोड़ों का उपयोग करके सचित्र किया गया है। फिर, इन जीमेटियों पर गुणसूत्र अलगाव, स्पिंडल आकृति विज्ञान, और हिस्टोन एसिटिलेशन के वैश्विक पैटर्न की जांच के लिए इम्यूनोफ्लोरेसेंस और इमेज विश्लेषण का उपयोग किया जाता है। अंत में, रिवर्स-ट्रांसक्रिप्शन और मात्रात्मक पीसीआर का एक प्रोटोकॉल एमआरएनए अभिव्यक्ति के विश्लेषण के लिए वर्णित है।
कृंतक पशु मॉडल के मुकाबले घोड़ों ने आनुवंशिक हेरफेर की अनुमति नहीं दी है, हेरफेर करने में कम आसान है, और महंगा रखरखाव की आवश्यकता होती है। हालांकि, इस मॉडल को oocyte परिपक्वता के अध्ययन के लिए काफी रुचि हो रही है 9 , 10 मानवीय शरीर विज्ञान की समानता के कारण 11 , 12 </ Sup>। इसके अलावा, घोड़े में आईवीएम-आईवीएफ के विश्वसनीय प्रोटोकॉल का विकास पर्याप्त आर्थिक हित है, क्योंकि इससे उच्च आनुवंशिक मूल्य के मार्स से फोल्स की संख्या में वृद्धि की अनुमति होगी।
Oocytes पर प्रयोग करने की विशेषताओं में से एक, खासकर monovulatory प्रजातियों में, प्रतिबंधित नमूना उपलब्धता है। यह सीमा एक दृष्टिकोण, जो पहले चूहों में विकसित की गई थी, को घोषित किया गया था, जो क्रोमोसोम की गिनती का संचालन करने के लिए घोड़े oocytes 13 , 14 के लिए होता है जो नमूना नुकसान को कम करता है (अन्य उपलब्ध तकनीकों के साथ तुलना की चर्चा देखें)। इसके अलावा, एक तिहाई प्रतिदीप्ति धुंधला प्रोटोकॉल एक ही नमूना पर कई विश्लेषकों का संचालन करने के लिए अनुकूलित किया गया है, और क्यू-पीसीआर विश्लेषण केवल 2 oocytes के पूल पर किया गया।
कुल मिलाकर, वर्तमान अध्ययन में morphologically और biochemically चा के उद्देश्य से एक प्रयोगात्मक दृष्टिकोण का वर्णन हैघोड़े का oocyte, एक सेल प्रकार है कि कम नमूना उपलब्धता के कारण अध्ययन करने के लिए बेहद चुनौतीपूर्ण है की तरह। हालांकि, यह प्रजनन जीव विज्ञान और monovulatory प्रजातियों की बांझपन के हमारे ज्ञान का विस्तार कर सकते हैं
Protocol
Representative Results
Discussion
भले ही आईवीएम 20 से अधिक वर्षों तक घोड़ों में किया गया हो, हम अभी तक यह नहीं जानते हैं कि ओओसीइट भ्रूणीय एनेप्लोइडे का मूल हो सकता है, जैसा कि मनुष्य 17 के लिए प्रस्तावित किया गया है। शायद कारण यह है…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों को लेजर स्कैनिंग confocal माइक्रोस्कोपी (एलएससीएम) , और फिलिप बैरियर और थियरी ब्लार्ड के साथ दैनिक अल्ट्रासाउंड डिम्बग्रंथि स्कैनिंग और एचसीजी इंजेक्शन के प्रदर्शन के लिए Fabrice Vincent का समर्थन करना चाहूंगा। यह काम "क्षेत्रीय सर्जेन्गा और क्षेत्रीय लोम्बार्डिया" परियोजना "पूर्व ओवो ओम्नीया" (अनुदान संख्या 260 9 6200 से एएमएल तक) में भाग में समर्थित था; "ल 'ओरियल इटालिया प्रति ली डोंने ई ला सिसिना 2012" फेलोशिप (अनुबंध 2012 से एफएफ), एफपी 7-पीपुले-2011-सीआईजी, रिसर्च एक्जिक्यूटिव एजेंसी (आरईए) "प्रो-ओवम" (अनुदान सं। 303640 से वीएल); और यूरोपीय सामाजिक निधि, मानव संसाधन विकास 2007-2013 के लिए क्षेत्रीय संचालन कार्यक्रम (संविदा संख्या POSDRU / 89 / 1.5 / एस / 62371 आईएम के लिए) द्वारा सह-वित्तपोषित कृषि और पशु चिकित्सा चिकित्सा के पोस्टडोक्लोरल स्कूल द्वारा। इन्स्टिट्यूट फ़्रान्सीसी डु चावल एट डे ल्यू इक्विटेशन द्वारा विवो ऑओसाइट संग्रह में वित्तपोषित किया गया था।
Materials
| ultrasound probe | Aloka | UST-5820-7,5 | |
| human chorionic gonadotrophin | centravet | CHO004 | 1500unit/animal IV |
| detomidine | centravet | MED010 | 9-15µg/kg IV |
| butylscopolamine bromure | centravet | EST001 | 0,2mg/kg IV |
| stereomicroscope | NIKON | SMZ-2B | |
| butorphanol | centravet | DOL003 | 10µg/kg IV |
| benzyl-penicillin | centravet | DEP203 IM | 15000UI/animal |
| TCM199 | Sigma-Aldrich | M3769 10X1L | powder for hepes-buffered TCM199 |
| Hepes sodium salt | Sigma-Aldrich | H3784-100G | |
| bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A8806 | |
| heparin | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
| NaHCO3-buffered TCM199 | Sigma-Aldrich | M2154-500ML | liquid for IVM medium |
| epidermal growth factor | Sigma-Aldrich | E4127 | |
| newborn calf serum | Sigma-Aldrich | N4762-500ML | |
| 4-well dishes | NUNCLON | 144444 | |
| incubator | Heraeus | BB6060 | |
| monastrol | Sigma-Aldrich | M8515 | |
| hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3506 | |
| pronase | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| polyvinyl alcohol | Sigma-Aldrich | 341584 | |
| triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| normal donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| rabbit anti-Aurora B phospho-Thr232 | BioLegend | 636102 | |
| TRITC-conjugated donkey anti-rabbit IgG | Vector Laboratories | 711-025-152 | |
| Vecta-Shield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| YOPRO1 | Thermofisher Scientific | Y3603 | |
| confocal laser scanning microscope | LSM 780 | Zeiss | |
| confocal laser scanning microscope | LSM 700 | Zeiss | |
| ImageJ software | rsb.info. nih.gov/ij/download.html | free resource | |
| mouse anti-alpha-tubulin | Sigma-Aldrich | T8203 | |
| rabbit anti-acH4K16 | Upstate Biotechnology | 07-329 | |
| AlexaFluor 488-coniugated donkey anti-mouse IgG | Life Technologies | A21202 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole | Sigma-Aldrich | D8417 | DAPI |
| centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| RNALater | Invitrogen | AM7020 | |
| Luciferase RNA | Promega | L4561 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | 12204-01 | |
| random hexamers | Thermofisher Scientific | N8080127 | |
| mouse Moloney leukaemia virus reverse transcriptase | Thermofisher Scientific | 28025013 | |
| SYBR green supermix | BioRad | 1708880 | |
| specific primers | Sigma-Aldrich | specific primers were designed using Primer3Plus software (free resource) | |
| thermal-cycler | BioRad | MyiQ | |
| mouse monoclonal anti-CENPA | Abcam | ab13939 | |
| mouse monoclonal anti-Aurora B | Abcam | ab3609 | |
Riferimenti
- Dellenbach, P. Transvaginal, sonographically controlled ovarian follicle puncture for egg retrieval. Lancet. 1 (8392), 1467 (1984).
- Humaidan, P. Ovarian hyperstimulation syndrome: review and new classification criteria for reporting in clinical trials. Hum Reprod. , (2016).
- Pincus, G., Enzmann, E. V. The Comparative Behavior of Mammalian Eggs in Vivo and in Vitro : I. The Activation of Ovarian Eggs. J Exp Med. 62 (5), 665-675 (1935).
- Emery, B. R., Wilcox, A. L., Aoki, V. W., Peterson, C. M., Carrell, D. T. In vitro oocyte maturation and subsequent delayed fertilization is associated with increased embryo aneuploidy. Fertil Steril. 84 (4), 1027-1029 (2005).
- Nichols, S. M., Gierbolini, L., Gonzalez-Martinez, J. A., Bavister, B. D. Effects of in vitro maturation and age on oocyte quality in the rhesus macaque Macaca mulatta. Fertil Steril. 93 (5), 1591-1600 (2010).
- Requena, A. The impact of in-vitro maturation of oocytes on aneuploidy rate. Reprod Biomed Online. 18 (6), 777-783 (2009).
- Franciosi, F. In vitro maturation affects chromosome segregation, spindle morphology and acetylation of lysine 16 on histone H4 in horse oocytes. Reprod Fertil Dev. , (2015).
- Franciosi, F. Changes in histone H4 acetylation during in vivo versus in vitro maturation of equine oocytes. Mol Hum Reprod. 18 (5), 243-252 (2012).
- Choi, Y. H., Gibbons, J. R., Canesin, H. S., Hinrichs, K. Effect of medium variations (zinc supplementation during oocyte maturation, perifertilization pH, and embryo culture protein source) on equine embryo development after intracytoplasmic sperm injection. Theriogenology. , (2016).
- Hendriks, W. K. Maternal age and in vitro culture affect mitochondrial number and function in equine oocytes and embryos. Reprod Fertil Dev. 27 (6), 957-968 (2015).
- Carnevale, E. M. The mare model for follicular maturation and reproductive aging in the woman. Theriogenology. 69 (1), 23-30 (2008).
- Ginther, O. J. The mare: a 1000-pound guinea pig for study of the ovulatory follicular wave in women. Theriogenology. 77 (5), 818-828 (2012).
- Chiang, T., Duncan, F. E., Schindler, K., Schultz, R. M., Lampson, M. A. Evidence that weakened centromere cohesion is a leading cause of age-related aneuploidy in oocytes. Curr Biol. 20 (17), 1522-1528 (2010).
- Duncan, F. E., Chiang, T., Schultz, R. M., Lampson, M. A. Evidence that a defective spindle assembly checkpoint is not the primary cause of maternal age-associated aneuploidy in mouse eggs. Biol Reprod. 81 (4), 768-776 (2009).
- Larionov, A., Krause, A., Miller, W. A standard curve based method for relative real time PCR data processing. BMC Bioinformatics. 6 (62), (2005).
- Choi, Y. H., Hochi, S., Braun, J., Sato, K., Oguri, N. In vitro maturation of equine oocytes collected by follicle aspiration and by the slicing of ovaries. Theriogenology. 40 (5), 959-966 (1993).
- Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
- Akiyama, T., Nagata, M., Aoki, F. Inadequate histone deacetylation during oocyte meiosis causes aneuploidy and embryo death in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (19), 7339-7344 (2006).
- Homer, H. A. Mad2 prevents aneuploidy and premature proteolysis of cyclin B and securin during meiosis I in mouse oocytes. Genes Dev. 19 (2), 202-207 (2005).
- Rambags, B. P. Numerical chromosomal abnormalities in equine embryos produced in vivo and in vitro. Mol Reprod Dev. 72 (1), 77-87 (2005).
- Nabti, I., Marangos, P., Bormann, J., Kudo, N. R., Carroll, J. Dual-mode regulation of the APC/C by CDK1 and MAPK controls meiosis I progression and fidelity. J Cell Biol. 204 (6), 891-900 (2014).
- Shomper, M., Lappa, C., FitzHarris, G. Kinetochore microtubule establishment is defective in oocytes from aged mice. Cell Cycle. 13 (7), 1171-1179 (2014).
- Luzzo, K. M. High fat diet induced developmental defects in the mouse: oocyte meiotic aneuploidy and fetal growth retardation/brain defects. PLoS One. 7 (11), e49217 (2012).
- Ma, P., Schultz, R. M. Histone deacetylase 2 (HDAC2) regulates chromosome segregation and kinetochore function via H4K16 deacetylation during oocyte maturation in mouse. PLoS Genet. 9 (3), e1003377 (2013).
- Yang, F., Baumann, C., Viveiros, M. M., De La Fuente, R. Histone hyperacetylation during meiosis interferes with large-scale chromatin remodeling, axial chromatid condensation and sister chromatid separation in the mammalian oocyte. Int J Dev Biol. 56 (10-12), 889-899 (2012).
- Luciano, A. M. Oocytes isolated from dairy cows with reduced ovarian reserve have a high frequency of aneuploidy and alterations in the localization of progesterone receptor membrane component 1 and aurora kinase B. Biol Reprod. 88 (3), 58 (2013).
- Luciano, A. M., Lodde, V., Franciosi, F., Ceciliani, F., Peluso, J. J. Progesterone receptor membrane component 1 expression and putative function in bovine oocyte maturation, fertilization, and early embryonic development. Reproduction. 140 (5), 663-672 (2010).
- Terzaghi, L. PGRMC1 participates in late events of bovine granulosa cells mitosis and oocyte meiosis. Cell Cycle. , 1-14 (2016).
- Susor, A., Jansova, D., Anger, M., Kubelka, M. Translation in the mammalian oocyte in space and time. Cell Tissue Res. 363 (1), 69-84 (2016).
- Chen, J. Genome-wide analysis of translation reveals a critical role for deleted in azoospermia-like (Dazl) at the oocyte-to-zygote transition. Genes Dev. 25 (7), 755-766 (2011).
- Ma, J., Flemr, M., Strnad, H., Svoboda, P., Schultz, R. M. Maternally recruited DCP1A and DCP2 contribute to messenger RNA degradation during oocyte maturation and genome activation in mouse. Biol Reprod. 88 (1), 11 (2013).
