Análise da segregação cromossômica, acetilação de histona e morfologia do fuso em ovócitos de cavalo
Summary
Este manuscrito descreve uma abordagem experimental para caracterizar morfologicamente e bioquimicamente ovócitos de cavalo. Especificamente, o presente trabalho ilustra como recolher ovócitos de equídeos imaturos e maduros por captação de óvulos guiados por ultra-som (OPU) e como investigar a segregação cromossómica, a morfologia do fuso, a acetilação das histonas globais ea expressão de mRNA.
Abstract
O campo da reprodução assistida tem sido desenvolvido para tratar a infertilidade em mulheres, animais de companhia e espécies ameaçadas. No cavalo, a reprodução assistida também permite a produção de embriões de alto desempenho sem interromper sua carreira esportiva e contribui para um aumento no número de potros de éguas de alto valor genético. O presente manuscrito descreve os procedimentos utilizados para a coleta de ovócitos imaturos e maduros de ovários de cavalo usando o coletor de óvulos (OPU). Estes oócitos foram então utilizados para investigar a incidência de aneuploidia através da adaptação de um protocolo previamente desenvolvido em ratinhos. Especificamente, os cromossomos e os centrómeros dos oócitos da metafase II (MII) foram marcados fluorescentemente e contados em planos focais sequenciais após varrimento de microscópio confocal a laser. Esta análise revelou uma incidência mais elevada na taxa de aneuploidia quando os oócitos imaturos foram recolhidos dos folículos e maturados in vitro em comparação comIn vivo. A imunocoloração para a tubulina ea forma acetilada da histona quatro em resíduos de lisina específicos também revelaram diferenças na morfologia do fuso meiótico e no padrão global de acetilação das histonas. Por fim, investigou-se a expressão de mRNAs que codificam histonas desacetilases (HDAC) e acetil-transferases (HATs) por transcrição reversa e PCR quantitativa (q-PCR). Não foram observadas diferenças na expressão relativa dos transcritos entre oócitos maturados in vitro e in vivo . De acordo com um silenciamento geral da actividade transcricional durante a maturação do oócito, a análise da quantidade total de transcrição só pode revelar estabilidade ou degradação do ARNm. Portanto, esses achados indicam que outras regulamentações de translação e pós-tradução podem ser afetadas.
Em geral, o presente estudo descreve uma abordagem experimental para caracterizar morfologicamente e bioquimicamente o oócito de cavalo, a ceTipo que é extremamente desafiador para estudar devido à baixa disponibilidade da amostra. No entanto, pode expandir nossos conhecimentos sobre a biologia reprodutiva e infertilidade em espécies monovulatórias.
Introduction
Uma vasta gama de técnicas de reprodução assistida foi desenvolvida para tratar a infertilidade em mulheres, animais de companhia e espécies ameaçadas de extinção. Um dos procedimentos mais comuns em contextos clínicos é a recuperação de oócitos da fase metafásica II (MII) dos folículos ovarianos por aspiração transvaginal guiada por ultrassom, captação de óvulos (OPU) 1 . Estes oócitos são então fertilizados in vitro (FIV), com o (s) embrião (s) resultante (s) implantado (s) num útero receptor. Os oócitos do estádio MII (maduro) são recuperados após a administração de gonadotropinas exógenas. No entanto, este tratamento está associado, em alguns pacientes, ao desenvolvimento da síndrome de hiperestimulação ovariana (OHSS) 2 .
Aproveitando a capacidade intrínseca de ovócitos inteiramente crescidos e imaturos (estágio GV) para retomar espontaneamente a meiose uma vez isolado de seus folículos, é possível obter oócitos maduros sem adminisGonadotropina 3 . Esse procedimento é chamado de maturação in vitro de oócitos (IVM) e representa uma abordagem menos voltada para o uso de drogas, menos dispendiosa e mais paciente para a tecnologia de reprodução assistida. No entanto, o sucesso do desenvolvimento embrionário com oócitos maturados in vitro é geralmente menor do que com os oócitos maturados in vivo 4 , 5 . Uma possível explicação é que os oócitos maturados in vitro são mais afetados por erros na segregação cromossômica, ea aneuploidia resultante prejudica o desenvolvimento embrionário normal 6 .
Compreender as bases moleculares da segregação cromossômica errada durante IVM acabaria por revelar o pleno potencial desta técnica. Nesta via, a abordagem experimental utilizada para investigar as características morfológicas e bioquímicas dos oócitos maturados in vitro , em comparação com a maturidade in vivoEd oócitos é aqui descrito 7 , 8 . Especificamente, os procedimentos para a OPU de oócitos imaturos e maduros e a IVM de oócitos imaturos são ilustrados usando cavalos adultos e de ciclismo natural como modelo experimental. Em seguida, a imunofluorescência e a análise de imagem são usadas para investigar a segregação cromossômica, a morfologia do fuso e o padrão global de acetilação das histonas nesses gametas. Finalmente, é descrito um protocolo de transcrição reversa e PCR quantitativa para a análise da expressão de mRNA.
Em comparação com modelos de animais roedores, os cavalos não permitem a manipulação genética, são menos fáceis de manipular e requerem manutenção cara. No entanto, este modelo está ganhando interesse considerável para o estudo da maturação do oócito 9,10 , devido à semelhança com a fisiologia ovariana humana 11 , 12 </ Sup>. Além disso, o desenvolvimento de protocolos confiáveis de IVM-IVF no cavalo tem um interesse econômico substancial, pois permitiria um aumento no número de potros de éguas de alto valor genético.
Uma das limitações da realização de experiências em oócitos, especialmente em espécies monovulatórias, é a disponibilidade restrita de amostras. Este limite foi superado aqui ajustando uma abordagem, previamente desenvolvida em ratinhos, a ovócitos de cavalo 13 , 14 para conduzir a contagem de cromossomas que minimiza a perda de amostra (ver a discussão para uma comparação com outras técnicas disponíveis). Além disso, um protocolo de coloração com fluorescência tripla foi otimizado para realizar múltiplas análises na mesma amostra, e as análises de q-PCR foram realizadas em pools de 2 oócitos apenas.
Em termos globais, o presente estudo descreve uma abordagem experimental destinada a caracterizar morfologicamente eRacterizar o oócito de cavalo, um tipo de célula que é extremamente desafiador para estudar devido à baixa disponibilidade da amostra. No entanto, pode expandir o nosso conhecimento da biologia reprodutiva e infertilidade das espécies monovulatórias.
Protocol
Representative Results
Discussion
Embora a IVM tenha sido realizada em cavalos há mais de 20 anos 16 , ainda não sabemos se o oócito pode ser a origem da aneuploidia embrionária, como tem sido proposto para os seres humanos 17 . A razão é provavelmente que a preparação de spreads de oócitos para contagem de cromossomos resulta em perda de amostra considerável. Com isto em mente, um levantamento dos métodos utilizados para investigar erros na segregação cromossômica foi conduzido para procurar…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores gostariam de agradecer a Fabrice Vincent pelo suporte com microscopia confocal de varredura a laser (LSCM) e Philippe Barrière e Thierry Blard pela realização de exames de ultra-sonografia ovariana diária e injeção de hCG. Este trabalho foi apoiado em parte pelo projecto "Ex Ovo Omnia" (Concessão nº 26096200 à AML) "Regione Sardegna and Regione Lombardia"; (Contrato 2012 a FF), FP7-PEOPLE-2011- CIG, Agência de Execução de Investigação (REA) "Pro-Ovum" (subvenção n.º 303640 a VL); E pela Escola de Pós-Doutoramento em Agricultura e Medicina Veterinária, co-financiada pelo Fundo Social Europeu, Programa Operacional Sectorial para o Desenvolvimento de Recursos Humanos 2007-2013 (Contrato POSDRU / 89 / 1.5 / S / 62371 ao IM). A coleta de oócitos in vivo foi financiada pelo Institut Français du Cheval et de l'Equitation.
Materials
| ultrasound probe | Aloka | UST-5820-7,5 | |
| human chorionic gonadotrophin | centravet | CHO004 | 1500unit/animal IV |
| detomidine | centravet | MED010 | 9-15µg/kg IV |
| butylscopolamine bromure | centravet | EST001 | 0,2mg/kg IV |
| stereomicroscope | NIKON | SMZ-2B | |
| butorphanol | centravet | DOL003 | 10µg/kg IV |
| benzyl-penicillin | centravet | DEP203 IM | 15000UI/animal |
| TCM199 | Sigma-Aldrich | M3769 10X1L | powder for hepes-buffered TCM199 |
| Hepes sodium salt | Sigma-Aldrich | H3784-100G | |
| bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A8806 | |
| heparin | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
| NaHCO3-buffered TCM199 | Sigma-Aldrich | M2154-500ML | liquid for IVM medium |
| epidermal growth factor | Sigma-Aldrich | E4127 | |
| newborn calf serum | Sigma-Aldrich | N4762-500ML | |
| 4-well dishes | NUNCLON | 144444 | |
| incubator | Heraeus | BB6060 | |
| monastrol | Sigma-Aldrich | M8515 | |
| hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3506 | |
| pronase | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
| polyvinyl alcohol | Sigma-Aldrich | 341584 | |
| triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| normal donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| rabbit anti-Aurora B phospho-Thr232 | BioLegend | 636102 | |
| TRITC-conjugated donkey anti-rabbit IgG | Vector Laboratories | 711-025-152 | |
| Vecta-Shield | Vector Laboratories | H-1000 | |
| YOPRO1 | Thermofisher Scientific | Y3603 | |
| confocal laser scanning microscope | LSM 780 | Zeiss | |
| confocal laser scanning microscope | LSM 700 | Zeiss | |
| ImageJ software | rsb.info. nih.gov/ij/download.html | free resource | |
| mouse anti-alpha-tubulin | Sigma-Aldrich | T8203 | |
| rabbit anti-acH4K16 | Upstate Biotechnology | 07-329 | |
| AlexaFluor 488-coniugated donkey anti-mouse IgG | Life Technologies | A21202 | |
| 4’,6-diamidino-2-phenylindole | Sigma-Aldrich | D8417 | DAPI |
| centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| RNALater | Invitrogen | AM7020 | |
| Luciferase RNA | Promega | L4561 | |
| PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | 12204-01 | |
| random hexamers | Thermofisher Scientific | N8080127 | |
| mouse Moloney leukaemia virus reverse transcriptase | Thermofisher Scientific | 28025013 | |
| SYBR green supermix | BioRad | 1708880 | |
| specific primers | Sigma-Aldrich | specific primers were designed using Primer3Plus software (free resource) | |
| thermal-cycler | BioRad | MyiQ | |
| mouse monoclonal anti-CENPA | Abcam | ab13939 | |
| mouse monoclonal anti-Aurora B | Abcam | ab3609 | |
Riferimenti
- Dellenbach, P. Transvaginal, sonographically controlled ovarian follicle puncture for egg retrieval. Lancet. 1 (8392), 1467 (1984).
- Humaidan, P. Ovarian hyperstimulation syndrome: review and new classification criteria for reporting in clinical trials. Hum Reprod. , (2016).
- Pincus, G., Enzmann, E. V. The Comparative Behavior of Mammalian Eggs in Vivo and in Vitro : I. The Activation of Ovarian Eggs. J Exp Med. 62 (5), 665-675 (1935).
- Emery, B. R., Wilcox, A. L., Aoki, V. W., Peterson, C. M., Carrell, D. T. In vitro oocyte maturation and subsequent delayed fertilization is associated with increased embryo aneuploidy. Fertil Steril. 84 (4), 1027-1029 (2005).
- Nichols, S. M., Gierbolini, L., Gonzalez-Martinez, J. A., Bavister, B. D. Effects of in vitro maturation and age on oocyte quality in the rhesus macaque Macaca mulatta. Fertil Steril. 93 (5), 1591-1600 (2010).
- Requena, A. The impact of in-vitro maturation of oocytes on aneuploidy rate. Reprod Biomed Online. 18 (6), 777-783 (2009).
- Franciosi, F. In vitro maturation affects chromosome segregation, spindle morphology and acetylation of lysine 16 on histone H4 in horse oocytes. Reprod Fertil Dev. , (2015).
- Franciosi, F. Changes in histone H4 acetylation during in vivo versus in vitro maturation of equine oocytes. Mol Hum Reprod. 18 (5), 243-252 (2012).
- Choi, Y. H., Gibbons, J. R., Canesin, H. S., Hinrichs, K. Effect of medium variations (zinc supplementation during oocyte maturation, perifertilization pH, and embryo culture protein source) on equine embryo development after intracytoplasmic sperm injection. Theriogenology. , (2016).
- Hendriks, W. K. Maternal age and in vitro culture affect mitochondrial number and function in equine oocytes and embryos. Reprod Fertil Dev. 27 (6), 957-968 (2015).
- Carnevale, E. M. The mare model for follicular maturation and reproductive aging in the woman. Theriogenology. 69 (1), 23-30 (2008).
- Ginther, O. J. The mare: a 1000-pound guinea pig for study of the ovulatory follicular wave in women. Theriogenology. 77 (5), 818-828 (2012).
- Chiang, T., Duncan, F. E., Schindler, K., Schultz, R. M., Lampson, M. A. Evidence that weakened centromere cohesion is a leading cause of age-related aneuploidy in oocytes. Curr Biol. 20 (17), 1522-1528 (2010).
- Duncan, F. E., Chiang, T., Schultz, R. M., Lampson, M. A. Evidence that a defective spindle assembly checkpoint is not the primary cause of maternal age-associated aneuploidy in mouse eggs. Biol Reprod. 81 (4), 768-776 (2009).
- Larionov, A., Krause, A., Miller, W. A standard curve based method for relative real time PCR data processing. BMC Bioinformatics. 6 (62), (2005).
- Choi, Y. H., Hochi, S., Braun, J., Sato, K., Oguri, N. In vitro maturation of equine oocytes collected by follicle aspiration and by the slicing of ovaries. Theriogenology. 40 (5), 959-966 (1993).
- Hassold, T., Hunt, P. To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy. Nat Rev Genet. 2 (4), 280-291 (2001).
- Akiyama, T., Nagata, M., Aoki, F. Inadequate histone deacetylation during oocyte meiosis causes aneuploidy and embryo death in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (19), 7339-7344 (2006).
- Homer, H. A. Mad2 prevents aneuploidy and premature proteolysis of cyclin B and securin during meiosis I in mouse oocytes. Genes Dev. 19 (2), 202-207 (2005).
- Rambags, B. P. Numerical chromosomal abnormalities in equine embryos produced in vivo and in vitro. Mol Reprod Dev. 72 (1), 77-87 (2005).
- Nabti, I., Marangos, P., Bormann, J., Kudo, N. R., Carroll, J. Dual-mode regulation of the APC/C by CDK1 and MAPK controls meiosis I progression and fidelity. J Cell Biol. 204 (6), 891-900 (2014).
- Shomper, M., Lappa, C., FitzHarris, G. Kinetochore microtubule establishment is defective in oocytes from aged mice. Cell Cycle. 13 (7), 1171-1179 (2014).
- Luzzo, K. M. High fat diet induced developmental defects in the mouse: oocyte meiotic aneuploidy and fetal growth retardation/brain defects. PLoS One. 7 (11), e49217 (2012).
- Ma, P., Schultz, R. M. Histone deacetylase 2 (HDAC2) regulates chromosome segregation and kinetochore function via H4K16 deacetylation during oocyte maturation in mouse. PLoS Genet. 9 (3), e1003377 (2013).
- Yang, F., Baumann, C., Viveiros, M. M., De La Fuente, R. Histone hyperacetylation during meiosis interferes with large-scale chromatin remodeling, axial chromatid condensation and sister chromatid separation in the mammalian oocyte. Int J Dev Biol. 56 (10-12), 889-899 (2012).
- Luciano, A. M. Oocytes isolated from dairy cows with reduced ovarian reserve have a high frequency of aneuploidy and alterations in the localization of progesterone receptor membrane component 1 and aurora kinase B. Biol Reprod. 88 (3), 58 (2013).
- Luciano, A. M., Lodde, V., Franciosi, F., Ceciliani, F., Peluso, J. J. Progesterone receptor membrane component 1 expression and putative function in bovine oocyte maturation, fertilization, and early embryonic development. Reproduction. 140 (5), 663-672 (2010).
- Terzaghi, L. PGRMC1 participates in late events of bovine granulosa cells mitosis and oocyte meiosis. Cell Cycle. , 1-14 (2016).
- Susor, A., Jansova, D., Anger, M., Kubelka, M. Translation in the mammalian oocyte in space and time. Cell Tissue Res. 363 (1), 69-84 (2016).
- Chen, J. Genome-wide analysis of translation reveals a critical role for deleted in azoospermia-like (Dazl) at the oocyte-to-zygote transition. Genes Dev. 25 (7), 755-766 (2011).
- Ma, J., Flemr, M., Strnad, H., Svoboda, P., Schultz, R. M. Maternally recruited DCP1A and DCP2 contribute to messenger RNA degradation during oocyte maturation and genome activation in mouse. Biol Reprod. 88 (1), 11 (2013).
