Analisi della segregazione dei cromosomi, acetilazione istonica e morfologia del mandrino nei cavalli ovociti

Federica Franciosi; Irene Tessaro; Rozenn Dalbies-Tran; Cecile Douet; Fabrice Reigner; Stefan Deleuze; Pascal Papillier; Ileana Miclea; Valentina Lodde; Alberto M. Luciano; Ghylene Goudet

doi:10.3791/55242

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Articolo metodologico

Analisi della segregazione dei cromosomi, acetilazione istonica e morfologia del mandrino nei cavalli ovociti

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DOI:

10.3791/55242

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11 maggio 2017

Federica Franciosi¹ , Irene Tessaro¹^,² , Rozenn Dalbies-Tran³ , Cecile Douet³ , Fabrice Reigner⁴ , Stefan Deleuze⁵ , Pascal Papillier³ , Ileana Miclea⁶ , Valentina Lodde¹ , Alberto M. Luciano¹ , Ghylene Goudet³

¹Department of Health, Animal Science and Food Safety, University of Milan, ²IRCCS. Istituto Ortopedico Galeazzi, ³PRC, CNRS, IFCE, Université de Tours, INRA, ⁴PAO, INRA, ⁵Clinique des Animaux de Compagnie et des Équidés, Université de Liège, ⁶University of Agricultural Sciences and Veterinary Medicine, Cluj-Napoca, Romania

In questo articolo

Sommario

Questo manoscritto descrive un approccio sperimentale per caratterizzare morfologicamente e biochimicamente i ovociti dei cavalli. In particolare, il presente lavoro illustra come raccogliere oociti di cavalli immaturi e maturi mediante raccolta di ovuli guidati da ultrasuoni (OPU) e come indagare la segregazione del cromosoma, la morfologia del mandrino, l'acetilazione degli istoni globali e l'espressione di mRNA.

Abstract

Il campo della riproduzione assistita è stato sviluppato per trattare l'infertilità in donne, animali da compagnia e specie in pericolo. Nel cavallo, la riproduzione assistita consente anche la produzione di embrioni da parte di artisti di alto livello senza interrompere la loro carriera sportiva e contribuisce ad aumentare il numero di puledri provenienti da greggi di alto valore genetico. Il presente manoscritto descrive le procedure utilizzate per la raccolta di ovociti immature e mature da ovari a cavallo mediante prelevamento di ovuli (OPU). Questi oociti sono stati poi usati per indagare l'incidenza di aneuploidy adattando un protocollo precedentemente sviluppato nei topi. In particolare, i cromosomi ei centrometi di oociti metafase II (MII) sono stati etichettati in fluorescenza e contati su piani focali sequenziali dopo la scansione a microscopio laser confocale. Questa analisi ha rivelato una maggiore incidenza nel tasso di aneuploidy quando ovociti immature sono stati raccolti dai follicoli e maturati in vitro rispetto aIn vivo. Immunostaining per tubulin e la forma acetilata di istone 4 a residui di lisina specifici hanno anche rivelato differenze nella morfologia del mandrino meiotico e nel modello globale di acetilazione istone. Infine, l'espressione di mRNA che codificano le deacetilasi dell'istone (HDACs) e acetil-transferasi (HAT) è stata studiata mediante trascrizione inversa e PCR quantitativa (q-PCR). Nessuna differenza nell'espressione relativa dei trascritti è stata osservata tra ovociti maturi in vitro e in vivo . In accordo con un silenziamento generale dell'attività trascrizionale durante la maturazione di oociti, l'analisi della quantità totale di trascritti può rivelare solo la stabilità o la degradazione della mRNA. Pertanto, questi risultati indicano che potrebbero essere interessate altre normative traslazionali e post-traduzionali.

Nel complesso, il presente studio descrive un approccio sperimentale che caratterizza morfologicamente e biochimicamente l'ovocita dei cavalli, una ceLl tipo che è estremamente impegnativo da studiare a causa della scarsa disponibilità di campioni. Tuttavia, può espandere le nostre conoscenze sulla biologia riproduttiva e sulla sterilità in specie monovulatorie.

Introduzione

Una vasta gamma di tecniche di riproduzione assistita è stata sviluppata per trattare l'infertilità in donne, animali da compagnia e specie in pericolo. Una delle procedure più comuni nelle impostazioni cliniche è il recupero di oociti di fase metafase II (MII) dai follicoli ovarici mediante aspirazione transvaginale guidata da ultrasuoni, prelevamento ovulo (OPU) ¹ . Questi oociti vengono poi fecondati in vitro (IVF), con gli embrioni risultanti impiantati in un utero ricevente. Gli oociti di fase MII (maturi) vengono recuperati a seguito della somministrazione di gonadotropine esogene. Tuttavia, questo trattamento è associato, i....