Bu el yazması, at oositlerini morfolojik ve biyokimyasal olarak karakterize eden deneysel bir yaklaşımı anlatmaktadır. Özellikle mevcut çalışma, ultrason kılavuzluğundaki ovum toplama (OPU) ile olgunlaşmamış ve olgun ata oositlerinin nasıl toplanacağını ve kromozom ayrımını, iğ morfolojisini, küresel histone asetilasyonunu ve mRNA ekspresyonunu nasıl araştıracağını göstermektedir.
Yardımlı üreme alanı kadınlar, eşlik eden hayvanlar ve nesli tükenmekte olan türlerde infertiliteyi tedavi etmek için geliştirilmiştir. Atta, yardımlı üreme, yüksek meslek sahiplerinden, spor kariyerine ara vermeden embriyoların üretilmesine olanak tanır ve yüksek genetik değerdeki kısraktan tüy sayısındaki artışa katkıda bulunur. Mevcut yazıda, yumurtalık toplama (OPU) kullanılarak at yumurtalıklarında olgunlaşmamış ve olgunlaşmış oositlerin toplanması için kullanılan prosedürler açıklanmaktadır. Bu oositler daha önce farelerde geliştirilen bir protokolü uyarlayarak anöploidite insidansını araştırmak için kullanıldı. Spesifik olarak, kromozomlar ve metafaz II (MII) oositlerinin santromerleri floresan olarak etiketlendi ve konfokal lazer mikroskop taramasından sonra ardışık odak planlarında sayıldı. Bu analiz, olgunlaşmamış oositler folliküllerden toplandığında ve in vitro olarak olgunlaştığında anöploidi oranının daha yüksek bir insidans olduğunu ortaya koymuşturIn vivo olarak. Tübülin için immün boyama ve spesifik lizin kalıntılarında dört aseton formatlı histon da mayotik iğnün morfolojisinde ve histon asetilasyonunun global modelinde farklılıklar ortaya çıkarmıştır. Son olarak, histon deasetilaz (HDAC) ve asetil transferazları (HAT) kodlayan mRNA'ların ifadesi, ters transkripsiyon ve kantitatif PCR (q-PCR) ile araştırıldı. Transkriptlerin nispi ekspresyonunda in vitro ve in vivo olgunlaşmış oositler arasında herhangi bir fark gözlemlenmedi. Oosit olgunlaşması sırasında transkripsiyonel aktivitenin genel bir susturulması ile uyumlu olarak, toplam transkript miktarının analizi sadece mRNA stabilitesini veya bozunumunu ortaya çıkarabilir. Bu nedenle, bu bulgular, diğer çeviri ve çevirim sonrası düzenlemelerin etkilenebileceğini göstermektedir.
Genel olarak, bu çalışmada morfolojik ve biyokimyasal olarak at oositinin karakterize edilmesine yönelik deneysel bir yaklaşım açıklanmaktadır.Düşük örnek kullanılabilirliği nedeniyle çalışmak son derece zorlu bir yazın. Bununla birlikte, monovulatör türlerde üreme biyolojisi ve infertilite hakkındaki bilgilerimizi genişletebilir.
Kadınlar, eşlik eden hayvanlar ve nesli tükenmekte olan türlerde infertiliteyi tedavi etmek için çok sayıda yardımcı üreme tekniği geliştirilmiştir. Klinik ortamdaki en yaygın prosedürlerden biri, ultrason kılavuzluğunda transvaginal aspirasyon, ovum pick-up (OPU) 1 ile yumurtalık folliküllerinden metafaz II (MII) evre oositlerinin alınmasıdır. Bu oositler daha sonra in vitro döllenir (IVF) ve elde edilen embriyo bir alıcı rahime implante edilir. MII evresi (olgun) oositler, eksojen gonadotropinlerin uygulanmasından sonra alınır. Bununla birlikte, bu tedavi, bazı hastalarda, yumurtalık hiperstimülasyon sendromu (OHSS) 2 gelişimi ile ilişkilidir.
Tam olarak yetişmiş olgunlaşmamış oositlerin (GV evresi) folliküllerinden bir kez izole edilmiş mayonezleri kendiliğinden sürdürebilme yeteneğinden faydalanmak suretiyle, idare olmadan olgun oositlerin elde edilmesi mümkündürTering gonadotropin 3 . Bu prosedüre, oosit in vitro olgunlaşma (IVM) denir ve yardımcı üreme teknolojisi için daha az ilaç odaklı, daha ucuz ve daha hasta dostu bir yaklaşım temsil eder. Bununla birlikte, embriyo gelişiminin in vitro olarak değiştirilmiş oositlerle başarısı, genellikle in vivo olgunlaşmış oositlerde 4 , 5 olanlarla karşılaştırıldığında daha düşüktür. Olası bir açıklama , in vitro olgunlaşmış oositlerin kromozom ayrışımındaki hatalar tarafından daha fazla etkilenmesi ve oluşan anöploidinin normal embriyonik gelişimi bozmasıdır.
IVM sırasında kromozomal mis-segregasyonun moleküler temelini anlamak, sonuçta bu tekniğin tam potansiyelini açığa vuracaktır. Bu bağlamda , in vivo matur ile karşılaştırıldığında , in vitro olarak değişime uğramış oositlerin morfolojik ve biyokimyasal özelliklerini araştırmak için kullanılan deneysel yaklaşımEd oositler burada 7,8 tarif edilmiştir. Özellikle, olgunlaşmamış ve olgunlaşmış oositlerin OPU'su ve olgunlaşmamış oositlerin IVM'si için prosedürler, deneysel bir model olarak erişkin ve doğal döngü atları kullanılarak gösterilmektedir. Ardından, kromozom ayrımı, iğ morfolojisi ve bu gametlerde histon asetilasyonunun genel paternini incelemek için immünofloresans ve görüntü analizi kullanılır. Son olarak, ters transkripsiyon ve kantitatif PCR protokolü, mRNA ekspresyonunun analizi için tarif edilmiştir.
Kemirgen hayvan modelleriyle karşılaştırıldığında, atlar genetik manipülasyona izin vermez, manipüle edilmesi daha kolaydır ve pahalı bakım gerektirirler. Bununla birlikte, bu model insan yumurtalık fizyolojisine benzerliği nedeniyle oosit olgunlaştırma 9,10 çalışması için büyük ilgi kazanmaktadır 11,12 </ Sup>. Üstelik, yüksek genetik değere sahip kanatlılardan tüylü hayvan sayısının artmasına olanak tanıyacak şekilde, atın IVM-IVF güvenilir protokollerinin geliştirilmesi önemli bir ekonomik ilgiye sahiptir.
Oositlerde, özellikle de monovulatory türlerde deney yapmanın kısıtlamalardan biri, kısıtlı örneklerin bulunmasıdır. Bu limit, burada, daha önce farelerde geliştirilmiş bir yaklaşımı, örnek kaybını en aza indirgeyen kromozom sayımı yapmak için 13 , 14 atı oositlerine ayarlamakla (diğer mevcut tekniklerle karşılaştırma için tartışmaya bakarak) üstesinden gelinmiştir. Ayrıca, aynı numunede birden fazla analiz yapmak için üçlü flüoresans boyama protokolü optimize edilmiş ve sadece 2 oosit hücrelerinde q-PCR analizleri gerçekleştirilmiştir.
Genel olarak, bu çalışmada morfolojik ve biyokimyasal olarak amaçlanan deneysel bir yaklaşım açıklanmaktadır.Düşük örnek varlığı nedeniyle son derece zorlu bir hücre türü olan at oositini ractere edin. Bununla birlikte, monovulatör türlerin üreme biyolojisi ve infertilitesi hakkındaki bilgilerimizi genişletebilir.
IVM, atlarda 20 yıldan fazla bir süredir gerçekleştirilmiş olsa da 16 , oositin embriyonik anöploidinin kökeni olup olamayacağını henüz bilemiyoruz, çünkü insanlar için önerilmişti 17 . Bunun nedeni muhtemelen kromozom sayımı için oosit yayılımının hazırlanmasının önemli numune kaybına yol açmasıdır. Bu düşünceyle, at oositlerine en uygun tekniği bulmak için kromozom ayrımındaki hataları araştırmak için kullanılan yöntemlerin ar…
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar Fabrice Vincent'a lazer tarama konfokal mikroskobu (LSCM) desteği ve Philippe Barrière ve Thierry Blard'a günlük ultrasonlu ovarian tarama ve hCG enjeksiyonu yapmaları için teşekkür etmek istiyorlar. Bu çalışma kısmen "Regione Sardegna ve Regione Lombardia" projesi "Ex Ovo Omnia" (Grub no 26096200, AML'ye) tarafından desteklendi; "2012 Olimpiyatları İçin L'Oreal Italia" bursu (Sözleşme 2012'den FF'ye), FP7-PEOPLE-2011-CIG, Araştırma İcra Ajansı (REA) "Pro-Ovum" (Hibe No: 303640'dan VL'ye); Ve Avrupa Sosyal Fonu, 2007-2013 İnsan Kaynaklarının Geliştirilmesi için Sektörel Operasyonel Programı (Sözleşme No. POSDRU / 89 / 1.5 / S / 62371'den IM'ye) tarafından birlikte finanse edilen Doktora Sonrası Tarım ve Veterinerlik Okulu tarafından hazırlanmıştır. In vivo oosit koleksiyonu Institut Français du Cheval et de l'Equitation tarafından finanse edildi.
ultrasound probe | Aloka | UST-5820-7,5 | |
human chorionic gonadotrophin | centravet | CHO004 | 1500unit/animal IV |
detomidine | centravet | MED010 | 9-15µg/kg IV |
butylscopolamine bromure | centravet | EST001 | 0,2mg/kg IV |
stereomicroscope | NIKON | SMZ-2B | |
butorphanol | centravet | DOL003 | 10µg/kg IV |
benzyl-penicillin | centravet | DEP203 IM | 15000UI/animal |
TCM199 | Sigma-Aldrich | M3769 10X1L | powder for hepes-buffered TCM199 |
Hepes sodium salt | Sigma-Aldrich | H3784-100G | |
bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A8806 | |
heparin | Sigma-Aldrich | H3149-10KU | |
NaHCO3-buffered TCM199 | Sigma-Aldrich | M2154-500ML | liquid for IVM medium |
epidermal growth factor | Sigma-Aldrich | E4127 | |
newborn calf serum | Sigma-Aldrich | N4762-500ML | |
4-well dishes | NUNCLON | 144444 | |
incubator | Heraeus | BB6060 | |
monastrol | Sigma-Aldrich | M8515 | |
hyaluronidase | Sigma-Aldrich | H3506 | |
pronase | Sigma-Aldrich | P5147 | |
paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
polyvinyl alcohol | Sigma-Aldrich | 341584 | |
triton-X 100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
normal donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
rabbit anti-Aurora B phospho-Thr232 | BioLegend | 636102 | |
TRITC-conjugated donkey anti-rabbit IgG | Vector Laboratories | 711-025-152 | |
Vecta-Shield | Vector Laboratories | H-1000 | |
YOPRO1 | Thermofisher Scientific | Y3603 | |
confocal laser scanning microscope | LSM 780 | Zeiss | |
confocal laser scanning microscope | LSM 700 | Zeiss | |
ImageJ software | rsb.info. nih.gov/ij/download.html | free resource | |
mouse anti-alpha-tubulin | Sigma-Aldrich | T8203 | |
rabbit anti-acH4K16 | Upstate Biotechnology | 07-329 | |
AlexaFluor 488-coniugated donkey anti-mouse IgG | Life Technologies | A21202 | |
4’,6-diamidino-2-phenylindole | Sigma-Aldrich | D8417 | DAPI |
centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
RNALater | Invitrogen | AM7020 | |
Luciferase RNA | Promega | L4561 | |
PicoPure RNA Isolation Kit | Applied Biosystems | 12204-01 | |
random hexamers | Thermofisher Scientific | N8080127 | |
mouse Moloney leukaemia virus reverse transcriptase | Thermofisher Scientific | 28025013 | |
SYBR green supermix | BioRad | 1708880 | |
specific primers | Sigma-Aldrich | specific primers were designed using Primer3Plus software (free resource) | |
thermal-cycler | BioRad | MyiQ | |
mouse monoclonal anti-CENPA | Abcam | ab13939 | |
mouse monoclonal anti-Aurora B | Abcam | ab3609 |