Bedingte Reprogrammierung von Pediatric menschliche Speiseröhre Epithelzellen für den Einsatz im Tissue Engineering and Disease Investigation
Summary
Erweiterung der menschlichen pädiatrischen Ösophagus-Epithelzellen Verwendung bedingten Neuprogrammierung bietet Ermittler mit einem Patienten-spezifische Population von Zellen, die für das Engineering-Ösophagus-Konstrukte für die autologe Implantation verwendet werden können Defekte oder Verletzungen und dienen als Reservoir für die therapeutische Screening-Assays zu behandeln.
Abstract
Identifying and expanding patient-specific cells in culture for use in tissue engineering and disease investigation can be very challenging. Utilizing various types of stem cells to derive cell types of interest is often costly, time consuming and highly inefficient. Furthermore, undesired cell types must be removed prior to using this cell source, which requires another step in the process. In order to obtain enough esophageal epithelial cells to engineer the lumen of an esophageal construct or to screen therapeutic approaches for treating esophageal disease, native esophageal epithelial cells must be expanded without altering their gene expression or phenotype. Conditional reprogramming of esophageal epithelial tissue offers a promising approach to expanding patient-specific esophageal epithelial cells. Furthermore, these cells do not need to be sorted or purified and will return to a mature epithelial state after removing them from conditional reprogramming culture. This technique has been described in many cancer screening studies and allows for indefinite expansion of these cells over multiple passages. The ability to perform esophageal screening assays would help revolutionize the treatment of pediatric esophageal diseases like eosinophilic esophagitis by identifying the trigger mechanism causing the patient’s symptoms. For those patients who suffer from congenital defect, disease or injury of the esophagus, this cell source could be used as a means to seed a synthetic construct for implantation to repair or replace the affected region.
Introduction
Speiseröhren Tissue Engineering und eosinophile Ösophagitis (EoE) in den Mittelpunkt der Forschung in vielen Labors in den letzten zehn Jahren. Angeborene Defekte wie Ösophagusatresie, werden in etwa 1 : 4.000 Lebendgeburten gesehen, die in der unvollständigen Entwicklung der Speiseröhre führt zu der Unfähigkeit führt 1 zu essen. Die Inzidenz und Prävalenz von EoE sind auf dem Vormarsch , seit die Identifizierung des Krankheitsbild 1993 Die Inzidenz von EoE von 0,7 / 100.000 pro Person in einem Jahr bis 10 variiert und die Prävalenz von 0,2 bis 43 / 100.000 2 reichte. Eine neue attraktive chirurgischen Ansatz lange Lücke Ösophagusatresie Behandlung besteht Gewebekonstrukte für die Implantation bei der Erzeugung von patienteneigenen Zellen verwendet. Diese Zellen in Verbindung mit synthetischen Gerüst wird eine autologe Konstrukt zu erzeugen, die nicht Immunsuppression erfordert. Einige Gruppen haben bereits damit begonnen, die uns zu untersuchen7 – e der stielartigen Zellen für Speiseröhren Tissue Engineering 3 sowie die Verwendung von nativen Zellen der Speiseröhre epithelialen der Schleimhaut 4 neu zu besiedeln. Krankheiten, die in der Speiseröhre von pädiatrischen Patienten vorhanden sind, sind oft schwer ohne Eingriff zu diagnostizieren oder zu studieren. Darüber hinaus verewigt Verwendung von Tiermodellen oder in vitro – Modellen Zelllinie für Kinderkrankheiten wie EoE nicht die genaue Pathogenese der Erkrankung oder patientenspezifische Unterschiede umfassen 8. Daher ist die Fähigkeit eines Patienten Krankheitsprozess in vitro untersuchen , um bestimmte Krankheit auslösenden Antigene zu identifizieren, zu Grunde liegenden Mechanismen zu bewerten und medikamentöse Behandlungen zu untersuchen wäre neu und bieten Kliniker mit Informationen , die in der Patientenbehandlung helfen können.
Es wurden viele autolog oder patientenspezifische Zelltypen war die für die Verwendung in tissu vorgeschlagen wurden,e-Engineering und die menschliche Krankheit Pathogenese zu studieren. Einige dieser Zelltypen werden jedoch in ihrer Fähigkeit beschränkt genügend Zellen eines bestimmten Phänotyp zu erzeugen , ein großes Gerüst oder führen einen hohen Durchsatz in vitro Studien auf Saatgut. Die Verwendung von pluripotente oder multipotente Stammzellen hat das Thema vieler Forschungs Diskussion jedoch Einschränkungen und Nachteile für diese Zellen verwendet wurden und 9 beschrieben. Die Verwendung von humanen embryonalen Stammzellen ist stark diskutiert und präsentiert viele ethische Fragen auf. Am wichtigsten ist , bilden diese Zellen Teratome, die auf einen Tumor ähnlich sind, wenn sie von ihren pluripotenten Zustand nicht differenziert werden, bevor sie in einen lebenden Wirt 10 liefert. Ferner kann die Verwendung von embryonalen Stammzellen nicht patientenspezifisch und könnte eine allogene Reaktion und die Notwendigkeit einer Immunsuppression 10 hervorzurufen. Induzierte pluripotente Stammzellen (iPS-Zellen) sind pluripotente Zellen, die könnenaus patienteneigenen Zellen abgeleitet werden. Somatische Zellen, wie Hautzellen kann zu einem pluripotenten Zustand mit einer Vielzahl von integrative und nicht-integrative Techniken induziert werden. Diese Zellen dienen dann als patientenspezifische Zellquellen für das Tissue Engineering oder Krankheit Untersuchung. Die Integration von unerwünschten genetischen Materials in diesen Zellen ist ein Anliegen , viele beschrieben haben , und selbst wenn Sequenzen vollständig entfernt iPSCs erscheinen eine epigenetische "Gedächtnis" in Richtung der Zelltyp zu erhalten , von denen sie 11 abgeleitet wurden. Diese Zellen werden auch Teratome in vivo bilden , wenn nicht mehr als 11 vor der Transplantation differenziert. Viele Differenzierungs Protokolle wurden auf epithelialen Abstammungslinien 12 untersucht Fokussierungs, 13, 14, jedoch ist es sehr wichtig zu beachten , dass die Zelltypen am Ende der Differenzierung resultierenden sind nicht homogen und only besitzen einen Bruchteil der Zelltyp von Interesse. Dies führt zu einer geringen Ausbeute und die Notwendigkeit, den gewünschten Zelltyp zu reinigen. Obwohl iPSCs Quelle eine potentielle patientenspezifische Zell sind, um das Verfahren ein Zelltyp von Interesse entweder für das Tissue Engineering oder Krankheit Untersuchung erhalten sehr ineffizient ist.
Lunge 15, der Brust 16, Dünndarm 17, Kolon 18, der Blase 19 und die Speiseröhre 20: menschliche Epithelzellen wurden aus einer Vielzahl von sowohl erkrankten und nicht erkrankten Geweben im menschlichen Körper einschließlich erfolgreich isoliert. Es ist wichtig zu beachten , dass die menschliche Primärzellen eine endliche Anzahl von Durchgängen aufweisen , in dem der Phänotyp 21, 22 gehalten wird. Unglücklicherweise bedeutet dies, dass die Anzahl der Zellen für die Krankheits Untersuchung benötigt wird oder für ein angelegtes Gerüst Animpfenzur Implantation nicht erreicht werden kann. Daher werden neue Techniken benötigt Patientenzellen zu erweitern, während immer noch eine epitheliale Phänotyp beibehalten wird. Bedingte Umprogrammierung von normalen und Krebszellen epithelialen Feeder – Zellen und ROCK – Inhibitor verwendet wurde im Jahr 2012 von Liu et al. 2 3. unter Verwendung von bestrahlten Feeder-Zellen, ROCK-Inhibitor und bedingte Umprogrammierung Medium Diese Technik wurde verwendet Krebs Epithelzellen aus Biopsien von Prostata- und Brustkrebs erhalten zu erweitern. Ziel war es , genügend Zellen für in vitro – Assays , wie beispielsweise Arzneimittel – Screening erzeugen. Diese Technik ist in der Lage von Epithelzellen auf unbestimmte Zeit durch "Reprogrammierung" dieser Zellen zu einem Stamm- oder Vorläuferähnlichen Zustand erweitert, die hochproliferative ist. Es wurde gezeigt, dass diese Zellen nicht-tumorigen und besitzen nicht die Fähigkeit , Teratome 23, 24 zu bilden. Weiterhin keineChromosomenanomalien oder genetische Manipulationen waren anwesend , nachdem diese Zellen in Kultur Passagierung mit dieser Technik 23, 24. Am wichtigsten ist, sind diese Zellen nur in der Lage, in der nativen Zelltyp von Interesse zu unterscheiden. Daher bietet diese Technik ein großes Reservoir an patientenspezifische Epithelzellen für Krankheit Untersuchung oder das Tissue Engineering, ohne die Notwendigkeit für Verewigung.
Gewinnung von Epithelgewebe von einem bestimmten Organ, um Krankheitsprozesse zu studieren, ist oft begrenzt und nicht immer möglich, da das Patientenrisiko. Für jene Patienten, die an Erkrankungen der Speiseröhre oder Defekte, endoskopische Biopsie Retrieval ist eine minimal-invasive Ansatz zur Gewinnung von Epithelgewebe leiden, die dissoziiert werden können und bedingt eine unbegrenzte Zellquelle bereitzustellen umprogrammiert, die auf die Schleimhaut dieses Patienten-Ösophagus spezifisch ist. Dies ermöglicht dann für di – vitro – Studiender Epithelzellen Krankheitsprozesse und Bildschirm für potenzielle Therapeutika zu bewerten. Ein Krankheitsprozess, die sich stark von diesem Ansatz profitieren könnten , ist eosinophile Ösophagitis, die als allergische Erkrankung der Speiseröhre 8 beschrieben wurde. Allergietests sowie therapeutische Ansätze könnten in vitro ausgewertet werden , um die eigene Epithelzellen des Patienten verwenden und diese Daten können dann auf den behandelnden Arzt übergeben werden individuelle Behandlungspläne zu entwickeln. Die Technik der bedingten Umprogrammierung in Verbindung mit endoskopischen Biopsien von pädiatrischen Patienten erhalten, bietet die Fähigkeit, normale Speiseröhre epithelialen Zellen von jedem Patienten auf unbestimmte Zeit zu erweitern. Diese Zellquelle daher zusammen mit natürlichen oder synthetischen Gerüst gepaart werden, um eine patientenspezifische chirurgische Option für Defekte, eine Krankheit oder ein Trauma zu liefern. eine unbestimmte Anzahl von Zellen zu haben würde helfen, Speiseröhren Konstrukte entwickeln, die eine vollständig reseeded besitzenzu helfen, erleichtern die Regeneration der verbleibenden Zelltypen mit Ösophagus-Epithelzellen, um das Lumen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Die wichtigsten Schritte, um Epithelzellen der Speiseröhre von Patienten-Biopsien zu isolieren und zu erweitern sind: 1) ausreichend Biopsiegewebe mit minimaler Zelltod dissoziierenden; 2) sorgen für ROCK-Inhibitor zu dem Zellkulturmedium bei jedem Mediumwechsel gegeben; 3) Nehmen Sie nicht mehr Feeder-Zellen verwenden als empfohlen; 4) halten eine saubere aseptischen Kultur; und 5) Passage Zellen unmittelbar vor dem Erreichen der Konfluenz.
Aufgrund der patientenbezogenen Unterschiede in …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to acknowledge Connecticut Children’s Medical Center Strategic Research Funding for supporting this work.
Materials
| Primocin | InVivogen | ant-pm2 | |
| Isopentane | Sigma Aldrich | 277258-1L | |
| Gelatin From Porcine Skin | Sigma Aldrich | G1890-100G | |
| DMEM | Thermofisher Scientific | 11965092 | |
| Cryomold | TissueTek | 4565 | |
| Cryomatrix OCT | Thermofisher Scientific | 6769006 | |
| 15ml Conical Tubes | Denville Scientific | C1017-p | |
| Complete Keratinocyte Serum Free Medium | Thermofisher Scientific | 10724011 | |
| Penicillin Streptomycin | Thermofisher Scientific | 15140122 | |
| Glutamax | Thermofisher Scientific | 35050061 | |
| Insulin Solution | Sigma Aldrich | I9278-5ml | |
| Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
| ROCK Inhibitor (Y-27632) | Fisher Scientific | 125410 | |
| F-12 Medium | Thermofisher Scientific | 11765054 | |
| Fetal Bovine Serum | Denville Scientific | FB5001 | |
| Dispase | Thermofisher Scientific | 17105041 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermofisher Scientific | 25300062 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Thermofisher Scientific | 25200072 | |
| 100mm Dishes | Denville Scientific | T1110-20 | |
| 150mm Dishes | Denville Scientific | T1115 | |
| 50ml Conicals | Denville Scientific | C1062-9 | |
| Phosphate Buffered Saline Tablets | Fisher Scientific | BP2944-100 | |
| 5ml Pipettes | Fisher Scientific | 1367811D | |
| 10ml Pipettes | Fisher Scientific | 1367811E | |
| 25ml Pipettes | Fisher Scientific | 1367811 | |
| 9" Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| NIH 3T3 Cells | ATCC | CRL1658 |
Riferimenti
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