Summary

ऊतक इंजीनियरिंग और रोग जांच में उपयोग के लिए बाल चिकित्सा मानव इसोफेजियल उपकला कोशिकाओं की सशर्त Reprogramming

Published: March 22, 2017
doi:

Summary

सशर्त reprogramming उपयोग मानव बाल चिकित्सा esophageal उपकला कोशिकाओं के विस्तार कोशिकाओं का एक रोगी विशेष आबादी कि ऑटोलॉगस प्रत्यारोपण के लिए esophageal निर्माणों इंजीनियरिंग दोष या चोट का इलाज और चिकित्सीय जांच assays के लिए एक जलाशय के रूप में सेवा करने के लिए उपयोग किया जा सकता है के साथ जांचकर्ताओं प्रदान करता है।

Abstract

Identifying and expanding patient-specific cells in culture for use in tissue engineering and disease investigation can be very challenging. Utilizing various types of stem cells to derive cell types of interest is often costly, time consuming and highly inefficient. Furthermore, undesired cell types must be removed prior to using this cell source, which requires another step in the process. In order to obtain enough esophageal epithelial cells to engineer the lumen of an esophageal construct or to screen therapeutic approaches for treating esophageal disease, native esophageal epithelial cells must be expanded without altering their gene expression or phenotype. Conditional reprogramming of esophageal epithelial tissue offers a promising approach to expanding patient-specific esophageal epithelial cells. Furthermore, these cells do not need to be sorted or purified and will return to a mature epithelial state after removing them from conditional reprogramming culture. This technique has been described in many cancer screening studies and allows for indefinite expansion of these cells over multiple passages. The ability to perform esophageal screening assays would help revolutionize the treatment of pediatric esophageal diseases like eosinophilic esophagitis by identifying the trigger mechanism causing the patient’s symptoms. For those patients who suffer from congenital defect, disease or injury of the esophagus, this cell source could be used as a means to seed a synthetic construct for implantation to repair or replace the affected region.

Introduction

इसोफेजियल ऊतक इंजीनियरिंग और इओसिनोफिलिक ग्रासनलीशोथ (EOE) ने पिछले एक दशक में कई प्रयोगशालाओं में अनुसंधान का ध्यान केंद्रित किया गया है। ऐसे esophageal अविवरता के रूप में जन्मजात दोष, लगभग 1 4000 में जीवित जन्मों, जो घेघा असमर्थता के प्रमुख के अधूरे विकास में यह परिणाम 1 खाने के लिए में देखा जाता है। घटना और EOE के प्रसार वृद्धि के बाद से कभी 1993 में रोग इकाई की पहचान EOE की घटनाओं में 10 / 100,000 प्रति व्यक्ति साल के लिए 0.7 से अलग और व्यापकता 43 / 100,000 2 के लिए 0.2 से लेकर पर किया गया है। लंबे अंतराल के esophageal अविवरता के इलाज के लिए एक नया आकर्षक शल्य दृष्टिकोण आरोपण मरीज की अपनी कोशिकाओं के उपयोग के लिए ऊतक निर्माणों को पैदा करने में होते हैं। सिंथेटिक मचान के साथ संयोजन के रूप में इन कोशिकाओं को एक ऑटोलॉगस का निर्माण है कि प्रतिरक्षा दमन की आवश्यकता नहीं है उत्पन्न होगा। कुछ समूह पहले से ही हमें जांच करने के लिए शुरू कर दिया हैesophageal ऊतक इंजीनियरिंग 3 के रूप में अच्छी तरह के रूप में देशी esophageal उपकला कोशिकाओं के उपयोग के लिए स्टेम कोशिकाओं की तरह के ई म्यूकोसा फिर से आबाद 4 7। रोग कि बाल चिकित्सा रोगियों की घेघा में मौजूद हैं अक्सर निदान या हस्तक्षेप के बिना अध्ययन करने के लिए मेहनत कर रहे हैं। इसके अलावा, उपयोग पशु मॉडल या इन विट्रो में EOE की तरह बाल रोगों के लिए सेल लाइन मॉडल अमर सटीक रोग रोगजनन या रोगी विशिष्ट मतभेद 8 धरना नहीं है। इसलिए, क्रम में इन विट्रो में एक मरीज की बीमारी की प्रक्रिया का अध्ययन करने की क्षमता विशेष बीमारी को ट्रिगर एंटीजन की पहचान, अंतर्निहित तंत्र का मूल्यांकन करने और दवा उपचार की जांच उपन्यास हो सकता है और जानकारी है कि मरीज के इलाज में सहायता कर सकते हैं के साथ चिकित्सकों प्रदान करेगा करने के लिए।

वहाँ कई ऑटोलॉगस या रोगी विशेष प्रकार की कोशिकाओं कि Tissu में उपयोग के लिए प्रस्तावित किया गया है किया गया हैई इंजीनियरिंग और मानव रोग रोगजनन का अध्ययन। हालांकि, इन प्रकार की कोशिकाओं में से कुछ एक बड़े पाड़ बीज या इन विट्रो अध्ययन में उच्च throughput प्रदर्शन करने के लिए एक विशिष्ट phenotype के लिए पर्याप्त कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए अपनी क्षमता में सीमित कर रहे हैं। Pluripotent या multipotent स्टेम कोशिकाओं का उपयोग अधिक से अधिक शोध चर्चा का विषय रहा है, हालांकि, सीमाओं और इन कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए कमियों को अच्छी तरह से 9 वर्णित किया गया है। मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के उपयोग के उच्च बहस और कई नैतिक मुद्दों को प्रस्तुत करता है। सबसे महत्वपूर्ण बात, इन कोशिकाओं teratomas है, जो एक ट्यूमर के समान हैं, अगर वे अपने pluripotent राज्य से पूर्व उन्हें एक जीवित मेजबान 10 में पहुंचाने के लिए भेदभाव नहीं कर रहे हैं के रूप में। इसके अलावा, भ्रूण स्टेम कोशिकाओं के उपयोग रोगी विशेष नहीं होगा और एक allogenic प्रतिक्रिया और प्रतिरक्षा दमन 10 के लिए जरूरत बटोर सकता है। प्रेरित pluripotent स्टेम सेल (IPSCs) pluripotent कोशिकाओं है कि कर सकते हैंएक मरीज की अपनी कोशिकाओं से प्राप्त किया जा। ऐसी त्वचा कोशिकाओं के रूप में दैहिक कोशिकाओं, एकीकृत और गैर-एकीकृत विभिन्न तकनीकों का उपयोग करते हुए एक pluripotent राज्य के लिए प्रेरित किया जा सकता है। इन कोशिकाओं को फिर ऊतक इंजीनियरिंग या बीमारी की जांच के लिए एक रोगी विशेष सेल के सूत्रों के रूप में सेवा करते हैं। इन कोशिकाओं में अवांछित आनुवंशिक सामग्री के एकीकरण के लिए एक चिंता का विषय है कई वर्णन किया है और भले ही दृश्यों रहे हैं पूरी तरह से हटा IPSCs सेल प्रकार, जहां से वे 11 प्राप्त किए गए दिशा में एक epigenetic "स्मृति" के संरक्षण के लिए दिखाई देते हैं। इन कोशिकाओं को भी विवो में teratomas फार्म यदि प्रत्यारोपण के 11 से पहले भेदभाव नहीं होगा। कई भेदभाव प्रोटोकॉल उपकला प्रजातियों 12, 13, 14 पर ध्यान केंद्रित कर जांच की गई है, हालांकि, यह ध्यान दें कि सेल प्रकार भेदभाव के अंत में जिसके परिणामस्वरूप समरूप और ओ नहीं हैं बहुत महत्वपूर्ण हैnly ब्याज की सेल प्रकार का एक अंश के पास है। यह कम पैदावार और वांछित सेल प्रकार शुद्ध करने के लिए की जरूरत में यह परिणाम है। हालांकि IPSCs एक संभावित रोगी विशेष सेल स्रोत हैं, इस प्रक्रिया को प्राप्त करने के लिए या तो ऊतक इंजीनियरिंग या बीमारी की जांच के लिए ब्याज की एक सेल प्रकार बहुत अक्षम है।

फेफड़ों के 15, स्तन 16, छोटी आंत 17, पेट के 18, मूत्राशय 19 और घेघा 20: मानव उपकला कोशिकाओं को सफलतापूर्वक सहित मानव शरीर में दोनों रोगग्रस्त और गैर रोगग्रस्त ऊतकों की एक किस्म से पृथक किया गया है। यह ध्यान रखें कि मानव प्राथमिक कोशिकाओं जिसमें phenotype 21, 22 बनाए रखा है मार्ग की एक निश्चित संख्या है महत्वपूर्ण है। दुर्भाग्य से, इसका मतलब है कि कोशिकाओं की संख्या की बीमारी की जांच के लिए या एक इंजीनियर पाड़ बोने के लिए आवश्यकआरोपण के लिए प्राप्त नहीं किया जा सकता है। इसलिए, नई तकनीक, जबकि अभी भी एक उपकला phenotype बनाए रखने मरीज की कोशिकाओं का विस्तार करने की जरूरत है। सामान्य और कैंसर उपकला फीडर कोशिकाओं और रॉक अवरोध का उपयोग कोशिकाओं की सशर्त reprogramming 2012 में लियू एट अल द्वारा वर्णित किया गया था। 2 से 3। इस तकनीक कैंसर उपकला विकिरणित फीडर कोशिकाओं, रॉक अवरोध और सशर्त reprogramming माध्यम का उपयोग कर प्रोस्टेट और स्तन कैंसर की बायोप्सी से प्राप्त कोशिकाओं का विस्तार करने के लिए उपयोग किया गया था। लक्ष्य ऐसी दवा स्क्रीनिंग के रूप में इन विट्रो assays के लिए पर्याप्त कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए किया गया था। इस तकनीक को "reprogramming" ये एक स्टेम या पूर्वज की तरह राज्य है, जो अत्यधिक proliferative है कोशिकाओं द्वारा अनिश्चित काल के लिए उपकला कोशिकाओं का विस्तार करने में सक्षम है। यह दिखा दिया है कि इन कोशिकाओं को गैर-tumorigenic कर रहे हैं और क्षमता teratomas 23, 24 के लिए फार्म के पास नहीं है। इसके अलावा, कोईगुणसूत्र असामान्यताओं या आनुवंशिक जोड़तोड़ इस तकनीक को 23, 24 का उपयोग करते हुए संस्कृति में इन कोशिकाओं passaging के बाद उपस्थित थे। सबसे महत्वपूर्ण बात, इन कोशिकाओं केवल ब्याज की मूल कोशिका प्रकार में अंतर करने में सक्षम हैं। इसलिए, इस तकनीक अमरता के लिए आवश्यकता के बिना रोग जांच या ऊतक इंजीनियरिंग के लिए रोगी विशेष उपकला कोशिकाओं का एक बड़ा जलाशय है।

रोग प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के क्रम में एक विशिष्ट अंग से उपकला ऊतक प्राप्त करने के लिए रोगी जोखिम के कारण अक्सर सीमित है और हमेशा संभव नहीं है। esophageal रोग या दोष से पीड़ित लोगों के रोगियों के लिए, इंडोस्कोपिक बायोप्सी पुनर्प्राप्ति उपकला ऊतक कि अलग किया जा सकता है और सशर्त अनिश्चितकालीन सेल स्रोत है कि मरीज की घेघा की म्यूकोसा के लिए विशिष्ट है प्रदान करने के लिए reprogrammed प्राप्त करने के लिए एक न्यूनतम इनवेसिव दृष्टिकोण है। यह तो इन विट्रो अध्ययन के लिए अनुमति देता हैउपकला कोशिकाओं के रोग प्रक्रियाओं और संभावित चिकित्सा विज्ञान के लिए स्क्रीन का मूल्यांकन करने के लिए। एक रोग प्रक्रिया है कि बहुत इस दृष्टिकोण से फायदा हो सकता eosinophilic ग्रासनलीशोथ, जो घेघा 8 की एलर्जी रोग के रूप में वर्णित किया गया है। एलर्जी परीक्षण के साथ ही चिकित्सकीय दृष्टिकोण मरीज की अपनी ही उपकला कोशिकाओं का उपयोग कर इन विट्रो में मूल्यांकन किया जा सकता है और इस डाटा तो इलाज चिकित्सक पर पारित किया जा सकता व्यक्तिगत उपचार योजना विकसित करने के लिए। बाल चिकित्सा रोगियों से इंडोस्कोपिक बायोप्सी प्राप्त करने के साथ संयोजन के रूप में सशर्त reprogramming की तकनीक किसी भी मरीज से अनिश्चित काल के लिए सामान्य esophageal उपकला कोशिकाओं का विस्तार करने की क्षमता प्रदान करता है। यह सेल स्रोत इसलिए प्राकृतिक या कृत्रिम मचान के साथ एक साथ मिलकर किया जा सकता है दोष, बीमारी या मानसिक आघात के लिए एक रोगी विशेष शल्य चिकित्सा का विकल्प प्रदान करते हैं। अनिश्चितकालीन सेल नंबर होने esophageal निर्माणों कि अधिकारी एक पूरी तरह से reseeded इंजीनियर मदद मिलेगीआदेश में esophageal उपकला कोशिकाओं के साथ लुमेन शेष प्रकार की कोशिकाओं के उत्थान की सुविधा मदद करने के लिए।

Protocol

सूचित सहमति के बाद बाल चिकित्सा रोगियों के माता-पिता / अभिभावक से और संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी # 13-094) के अनुसार प्राप्त हुई थी इसोफेजियल बायोप्सी प्राप्त किया गया। 1. स्टरलाइज़ उपकरण और जिलेटिन सम?…

Representative Results

रोगी बायोप्सी से esophageal उपकला कोशिकाओं को अलग करने में महत्वपूर्ण कदम का एक सारांश चित्रा 1 में संक्षेप। उपकला कोशिकाओं की कालोनियों लगभग 4-5 दिनों में बनेगी और fibroblast फीडर कोशिकाओं (2A च?…

Discussion

आदेश में मरीज बायोप्सी से अलग और esophageal उपकला कोशिकाओं का विस्तार करने में सबसे महत्वपूर्ण कदम उठाए हैं: 1) पर्याप्त रूप से कम से कम कोशिका मृत्यु के साथ बायोप्सी ऊतक अलग कर; 2) यह सुनिश्चित रॉक अवरोध हर मध्य?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

We would like to acknowledge Connecticut Children’s Medical Center Strategic Research Funding for supporting this work.

Materials

Primocin InVivogen ant-pm2
Isopentane Sigma Aldrich 277258-1L
Gelatin From Porcine Skin Sigma Aldrich G1890-100G
DMEM Thermofisher Scientific 11965092
Cryomold TissueTek 4565
Cryomatrix OCT Thermofisher Scientific 6769006
15ml Conical Tubes Denville Scientific C1017-p
Complete Keratinocyte Serum Free Medium Thermofisher Scientific 10724011
Penicillin Streptomycin Thermofisher Scientific 15140122
Glutamax Thermofisher Scientific 35050061
Insulin Solution Sigma Aldrich I9278-5ml
Human Epidermal Growth Factor (EGF) Peprotech AF-100-15
ROCK Inhibitor (Y-27632) Fisher Scientific 125410
F-12 Medium  Thermofisher Scientific 11765054
Fetal Bovine Serum Denville Scientific FB5001
Dispase Thermofisher Scientific 17105041
0.05% Trypsin-EDTA Thermofisher Scientific 25300062
0.25% Trypsin-EDTA Thermofisher Scientific 25200072
100mm Dishes Denville Scientific T1110-20
150mm Dishes Denville Scientific T1115
50ml Conicals Denville Scientific   C1062-9 
Phosphate Buffered Saline Tablets Fisher Scientific BP2944-100
5ml Pipettes Fisher Scientific 1367811D
10ml Pipettes Fisher Scientific 1367811E
25ml Pipettes Fisher Scientific 1367811
9" Pasteur Pipettes Fisher Scientific 13-678-20D
NIH 3T3 Cells ATCC CRL1658

Riferimenti

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Citazione di questo articolo
Jensen, T. J., Foster, C., Sayej, W., Finck, C. M. Conditional Reprogramming of Pediatric Human Esophageal Epithelial Cells for Use in Tissue Engineering and Disease Investigation. J. Vis. Exp. (121), e55243, doi:10.3791/55243 (2017).

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