Reprogramação condicional de células Pediátrica Humano esofágico epiteliais para uso em Engenharia de Tecidos e Doença de Investigação

Summary

Expansão de células epiteliais humanas esofágicas pediátricos utilizando reprogramação condicional fornece investigadores com uma população específica no paciente de células que pode ser utilizada para engenharia construções esofágicas autólogo para implantação para tratar defeitos ou ferimentos e servir como um reservatório para ensaios de pesquisa de terapêuticos.

Abstract

Identifying and expanding patient-specific cells in culture for use in tissue engineering and disease investigation can be very challenging. Utilizing various types of stem cells to derive cell types of interest is often costly, time consuming and highly inefficient. Furthermore, undesired cell types must be removed prior to using this cell source, which requires another step in the process. In order to obtain enough esophageal epithelial cells to engineer the lumen of an esophageal construct or to screen therapeutic approaches for treating esophageal disease, native esophageal epithelial cells must be expanded without altering their gene expression or phenotype. Conditional reprogramming of esophageal epithelial tissue offers a promising approach to expanding patient-specific esophageal epithelial cells. Furthermore, these cells do not need to be sorted or purified and will return to a mature epithelial state after removing them from conditional reprogramming culture. This technique has been described in many cancer screening studies and allows for indefinite expansion of these cells over multiple passages. The ability to perform esophageal screening assays would help revolutionize the treatment of pediatric esophageal diseases like eosinophilic esophagitis by identifying the trigger mechanism causing the patient’s symptoms. For those patients who suffer from congenital defect, disease or injury of the esophagus, this cell source could be used as a means to seed a synthetic construct for implantation to repair or replace the affected region.

Introduction

engenharia de tecidos e esofagite eosinofílica (EoE) têm sido o foco de pesquisas em muitos laboratórios ao longo da última década. Defeitos congênitos, como a atresia de esôfago, são vistos em aproximadamente 1 em cada 4.000 nascidos vivos, o que resulta no desenvolvimento incompleto do esôfago levando à incapacidade de comer ^1. A incidência e prevalência de EoE têm vindo a aumentar desde a identificação da entidade doença em 1993. A incidência de EoE variou entre 0,7 a 10 / 100.000 por pessoa-ano e a prevalência variou de 0,2-43 / 100.000 ^2. Uma nova abordagem cirúrgica atraente para o tratamento de longo intervalo atresia esofágica consiste na geração de construções de tecido para implante utilizando as células do próprio paciente. Estas células em conjunto com o andaime sintético irá gerar um construto autólogo que não exige imunossupressão. Alguns grupos já começaram a investigar os EUAe de células estaminais, como para engenharia de tecido esofágico ^3, bem como a utilização de células epiteliais esofágicas nativas para repovoar a mucosa ^4-7. Doenças que estão presentes no esófago do paciente pediátrico são muitas vezes difíceis de diagnosticar ou estudar sem intervenção. Além disso, utilizando modelos animais ou in vitro imortalizado modelos da linha celular para doenças pediátricas como EoE não abranger a patogênese da doença exata ou diferenças específicas dos pacientes ^8. Portanto, a capacidade para o estudo do processo de doença de um paciente in vitro, a fim de identificar antigénios específicos de doença desencadeamento, avaliar os mecanismos subjacentes e investigar tratamentos com drogas seria novo e proporcionar aos médicos com informações que podem ajudar no tratamento do paciente.

Tem havido muitos tipos de células autólogas ou específicas do paciente que têm sido propostas para utilização em tissue engenharia e estudando patogênese da doença humana. No entanto, alguns destes tipos de células são limitados na sua capacidade para gerar células suficientes de um fenótipo específico para semear um grande andaime ou executar alto rendimento em estudos in vitro. O uso de células-tronco pluripotentes ou multipotentes tem sido o tema de muita discussão pesquisa, no entanto, limitações e insuficiências para o uso dessas células têm sido bem descrito ^9. A utilização de células estaminais embrionárias humanas é altamente debatido e apresenta muitas questões éticas. Mais importante, estas células formam teratomas, que são semelhantes a um tumor, se eles não são diferenciados a partir de seu estado pluripotentes antes de entregar os em um hospedeiro vivo ^10. Além disso, a utilização de células estaminais embrionárias não seria-específico do paciente e pode desencadear uma resposta alogénica e a necessidade para a supressão imune ^10. Induzidas células-tronco pluripotentes (iPSCs) são células pluripotentes que podemser derivado a partir de células do próprio paciente. As células somáticas, tais como as células da pele, pode ser induzido para um estado pluripotente usando uma variedade de técnicas de integração e não-integrativos. Essas células, então, servir como uma fonte de células específicas do paciente para engenharia de tecidos ou de investigação da doença. A integração de material genético indesejado para estas células é uma preocupação muitos descreveram e mesmo sequências são completamente removidos iPSCs aparecem para conservar uma "memória" epigenética para o tipo de célula a partir da qual eles foram derivados ^11. Estas células também irá formar teratomas in vivo, se não diferenciadas antes do transplante ^11. Muitos protocolos de diferenciação têm sido investigados concentrando-se em linhagens epiteliais ^{12, 13, 14,} no entanto, é muito importante notar que os tipos de células que resultam no final de diferenciação não são homogéneos e óomente possuir uma fracção do tipo de células de interesse. Isto resulta em baixo rendimento e a necessidade de purificar o tipo de célula desejado. Embora iPSCs são uma potencial fonte de células específicas do paciente, o processo para obter um tipo de células de interesse, quer para a engenharia de tecidos ou de investigação da doença é muito ineficiente.

Células epiteliais humanas foram isolados com sucesso a partir de uma variedade de ambos os tecidos doentes e não doentes no corpo humano, incluindo: ¹⁵ pulmão, de mama ^{16, 17} intestino delgado, cólon ^{18, 19} da bexiga e do esófago ^20. É importante notar que as células humanas primárias têm um número finito de passagens em que o fenótipo é mantida ^{21, 22.} Infelizmente, isto significa que o número de células necessário para a investigação da doença ou para semear um andaime engenhariapara o implante não pode ser alcançado. Portanto, as novas técnicas são necessários para expandir células do paciente enquanto ainda mantém um fenótipo epitelial. Reprogramação condicional de células epiteliais normais e cancerosos utilizando células alimentadoras e inibidor ROCHA foi descrito em 2012 por Liu et al. ^{2 3.} Esta técnica foi utilizada para expandir células epiteliais cancerosas obtidos a partir de biópsias de câncer de próstata e de mama, utilizando células de alimentação irradiadas, inibidor ROCHA e médias reprogramação condicional. O objetivo era gerar células suficientes para ensaios in vitro, como o rastreio de drogas. Esta técnica é capaz de se expandir células epiteliais indefinidamente por "reprogramar" as células para um tronco ou progenitoras estado semelhante, que é altamente proliferativo. Foi demonstrado que estas células são não-tumorigénico e não possuem a capacidade para formar teratomas ^{23, 24.} Além disso, nenhumanomalias cromossómicas ou manipulações genéticas estavam presentes após passaging estas células em cultura usando esta técnica ^{23, 24.} Mais importante ainda, essas células só são capazes de se diferenciar em células do tipo nativo de interesse. Portanto, esta técnica oferece um grande reservatório de células epiteliais específicos do paciente para investigação da doença ou engenharia de tecidos sem a necessidade de imortalização.

A obtenção de tecido epitelial de um órgão específico, a fim de estudar processos de doença é muitas vezes limitada e nem sempre é possível, devido ao risco de paciente. Para os pacientes que sofrem de doença ou defeitos esofágico, recuperação endoscópica biópsia é uma abordagem minimamente invasiva para a obtenção de tecido epitelial que podem ser dissociados e condicionalmente reprogramadas de modo a proporcionar uma fonte de células indefinida que é específico para a mucosa do esófago que do paciente. Isso, então, permite estudos in vitrodas células epiteliais para avaliar os processos de doença e tela para potenciais agentes terapêuticos. Um processo de doença que poderiam beneficiar grandemente de esta abordagem é esofagite eosinofílica, que tem sido descrita como doença alérgica do esófago ^8. Testes de alergia, bem como abordagens terapêuticas poderiam ser avaliada in vitro utilizando as próprias células epiteliais do paciente e estes dados podem então ser transmitida para o médico assistente para desenvolver planos de tratamento individualizado. A técnica de reprogramação condicional em conjunto com a obtenção de biópsias endoscópicas de pacientes pediátricos oferece a capacidade de expandir as células epiteliais do esôfago normais por tempo indeterminado a partir de qualquer paciente. Esta fonte de células poderiam, portanto, ser agrupado em conjunto com andaimes natural ou sintética para fornecer uma opção cirúrgica específica para cada paciente por defeitos, doença ou trauma. Ter um número de celular por tempo indeterminado ajudaria engenharia construções de esôfago que possuem uma completamente reseededlúmen com células epiteliais esofágicas, a fim de ajudar a facilitar a regeneração dos tipos de células restantes.

Protocol

biópsias esofágicas foram obtidos após consentimento informado foi obtido dos pais / responsáveis ​​dos pacientes pediátricos e de acordo com a placa de revisão institucional (IRB # 13-094). 1. esterilização de instrumentos e gelatina Solution forceps autoclave, lâminas de barbear e tesouras antes de manusear do tecido para evitar a contaminação. Para fazer 200 ml de solução de gelatina a 0,1%, combinar 200 mL de água destilada com 0,2 g de gelatina. Autoclave e fresco ante…

Representative Results

Um resumo das principais etapas isolar células epiteliais do esôfago de biópsias de pacientes estão resumidos na Figura 1. As colónias de células epiteliais vai formar em cerca de 4-5 dias e vai ser rodeado por células de alimentação de fibroblastos (Figura 2A). À medida que essas colônias expandir eles vão fundir-se com outras colónias para formar grandes colônias (Figura 2B). Uma vez que as culturas se tornaram 70% conflu…

Discussion

Os passos mais importantes, a fim de isolar e expandir células epiteliais esofágicas a partir de biópsias de pacientes são: 1) dissociação adequadamente tecido de biopsia com a morte celular mínima; 2) assegurar ROCHA inibidor é adicionado ao meio de cultura de células em cada mudança de meio; 3) Não use mais células alimentadoras do que o recomendado; 4) manter uma cultura asséptica limpo; e 5) células de passagem apenas antes de atingir a confluência.

Devido às diferenças …

Materials

Primocin	InVivogen	ant-pm2
Isopentane	Sigma Aldrich	277258-1L
Gelatin From Porcine Skin	Sigma Aldrich	G1890-100G
DMEM	Thermofisher Scientific	11965092
Cryomold	TissueTek	4565
Cryomatrix OCT	Thermofisher Scientific	6769006
15ml Conical Tubes	Denville Scientific	C1017-p
Complete Keratinocyte Serum Free Medium	Thermofisher Scientific	10724011
Penicillin Streptomycin	Thermofisher Scientific	15140122
Glutamax	Thermofisher Scientific	35050061
Insulin Solution	Sigma Aldrich	I9278-5ml
Human Epidermal Growth Factor (EGF)	Peprotech	AF-100-15
ROCK Inhibitor (Y-27632)	Fisher Scientific	125410
F-12 Medium	Thermofisher Scientific	11765054
Fetal Bovine Serum	Denville Scientific	FB5001
Dispase	Thermofisher Scientific	17105041
0.05% Trypsin-EDTA	Thermofisher Scientific	25300062
0.25% Trypsin-EDTA	Thermofisher Scientific	25200072
100mm Dishes	Denville Scientific	T1110-20
150mm Dishes	Denville Scientific	T1115
50ml Conicals	Denville Scientific	C1062-9
Phosphate Buffered Saline Tablets	Fisher Scientific	BP2944-100
5ml Pipettes	Fisher Scientific	1367811D
10ml Pipettes	Fisher Scientific	1367811E
25ml Pipettes	Fisher Scientific	1367811
9" Pasteur Pipettes	Fisher Scientific	13-678-20D
NIH 3T3 Cells	ATCC	CRL1658