Условный Перепрограммирование педиатрический человеческого пищеводного эпителиальных клеток для использования в тканевой инженерии и профилактике заболеваний Исследование
Summary
Расширение педиатрических пищеводных эпителиальных клеток человека с использованием условного перепрограммирование обеспечивает исследователей с населением конкретного пациента клеток, которые могут быть использованы для проектирования пищеводные конструкции для аутогенной имплантации для лечения дефектов или травм, и служить в качестве резервуара для терапевтических методов скрининга.
Abstract
Identifying and expanding patient-specific cells in culture for use in tissue engineering and disease investigation can be very challenging. Utilizing various types of stem cells to derive cell types of interest is often costly, time consuming and highly inefficient. Furthermore, undesired cell types must be removed prior to using this cell source, which requires another step in the process. In order to obtain enough esophageal epithelial cells to engineer the lumen of an esophageal construct or to screen therapeutic approaches for treating esophageal disease, native esophageal epithelial cells must be expanded without altering their gene expression or phenotype. Conditional reprogramming of esophageal epithelial tissue offers a promising approach to expanding patient-specific esophageal epithelial cells. Furthermore, these cells do not need to be sorted or purified and will return to a mature epithelial state after removing them from conditional reprogramming culture. This technique has been described in many cancer screening studies and allows for indefinite expansion of these cells over multiple passages. The ability to perform esophageal screening assays would help revolutionize the treatment of pediatric esophageal diseases like eosinophilic esophagitis by identifying the trigger mechanism causing the patient’s symptoms. For those patients who suffer from congenital defect, disease or injury of the esophagus, this cell source could be used as a means to seed a synthetic construct for implantation to repair or replace the affected region.
Introduction
инженерия пищеводного ткани и эозинофильный эзофагит (EoE) были в центре внимания исследований во многих лабораториях за последнее десятилетие. Врожденные дефекты, такие как атрезия пищевода, наблюдаются примерно в 1 в 4000 родившихся живыми, что приводит к неполному развитию пищевода , приводящей к невозможности съесть 1. Заболеваемость и распространенность Eoe были на подъеме с тех пор определение сущности болезни в 1993 году заболеваемость Eoe колебалась от 0,7 до 10/100000 на человеко-год , а распространенность колебалась от 0,2 до 43 / 100,000 2. Новый привлекательный хирургический подход к лечению длительного перерыва атрезия пищевода состоит в создании конструкции ткани для имплантации с использованием собственных клеток пациента. Эти клетки в сочетании с синтетическим подмостей произведет аутологичной конструкцию, которая не требует иммуносупрессии. Некоторые группы уже начали исследовать насе стволовых клеток, как для тканевой инженерии пищеводного 3, а также использование местных эпителиальных клеток пищевода заселить слизистую оболочку 4 – 7. Болезни, которые присутствуют в пищевод педиатрических пациентов часто трудно диагностировать или изучать без вмешательства. Кроме того, использование модели на животных или в пробирке увековечены модели клеточной линии для педиатрических заболеваний , как Eoe не охватывают точную патогенез заболевания или пациента специфические различия 8. Таким образом, способность изучать процесс болезни пациента в пробирке с целью выявления конкретных заболеваний вызывая антигены, оценить основные механизмы и исследования лекарственной терапии было бы новым и предоставить врачам информацию , которая может помочь в лечении пациента.
Там было много аутологичных или пациент-специфические типы клеток, которые были предложены для использования в Tissuэлектронной инженерии и изучения патогенеза заболеваний человека. Тем не менее, некоторые из этих типов клеток ограничены в их способности генерировать достаточное количество клеток специфического фенотипа семян большой помост или выполнить высокую пропускную способность в пробирке исследования. Использование плюрипотентных или мультипотентных стволовых клеток была темой многих исследований , обсуждения, однако, ограничения и недостатки использования этих клеток были хорошо описаны 9. Использование человеческих эмбриональных стволовых клеток широко обсуждаемого и представляет множество этических проблем. Самое главное, что эти клетки образуют тератомы, которые похожи на опухоли, если они не отличаются от их плюрипотентных состояния перед подачей их в живом хозяине 10. Кроме того, использование эмбриональных стволовых клеток , не было бы специфическая для пациента и может вызвать реакцию аллогенных и необходимость подавления иммунитета 10. Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (ИПСК) являются плюрипотентные клетки, которые могутбыть получены из собственных клеток пациента. Соматические клетки, такие как клетки кожи, могут быть вызваны в плюрипотентное состояние, используя различные интегративные и не интегративные методов. Эти клетки затем служат в качестве пациента специфических клеточных источников для тканевой инженерии или расследования заболеваний. Интеграция нежелательного генетического материала в этих клетках вызывает озабоченность многие из них описаны и даже если последовательности полностью удаляются иПСК появляются , чтобы сохранить эпигенетическую "память" по отношению к типу клеток , из которых они были получены 11. Эти клетки также будут образовывать тератомы в естественных условиях , если не дифференцируются до трансплантации 11. Многие протоколы дифференцировки, сосредоточенные на эпителиальных родословных 12, 13, 14, тем не менее, очень важно отметить , что типы клеток , в результате в конце дифференцировки не однородны и Oолько обладают фракцию типа клеток, представляющих интерес. Это приводит к низкой производительности и необходимость очистить желаемый тип клеток. Хотя иПСК являются потенциальным пациентом конкретный источник клеток, процесс получения типа клеток, представляющих интерес для обеих тканевой инженерии или расследования болезней очень неэффективно.
Человеческие эпителиальные клетки были успешно выделены из различных обоих больных и не пораженных тканей в организме человека в том числе: 15 легких, рака молочной железы 16, тонкой кишки, толстой кишки 17 18, мочевого пузыря 19 и пищевода 20. Важно отметить , что первичные клетки человека имеют конечное число проходов , в которых фенотип поддерживается 21, 22. К сожалению, это означает, что число клеток, необходимых для исследования болезни или для высева сконструированным помостдля имплантации может быть не достигнута. Таким образом, новые технологии необходимы для расширения клетки пациента, сохраняя при этом эпителиального фенотипа. Условный перепрограммирование нормальных и раковых эпителиальных клеток с использованием фидерные клетки и ингибитор ROCK был описан в 2012 году Лю и др. 2 3. Эта методика была использована для расширения раковыми эпителиальные клетки, полученные из биопсии простаты и рака молочной железы с использованием облученные фидерные клетки, ингибитор ROCK и условно перепрограммирование среды. Цель состояла в том, чтобы генерировать достаточное количество клеток для анализов в пробирке , таких как скрининг наркотиков. Этот метод способен расширяться эпителиальные клетки на неопределенное время "перепрограммирования" этих клеток к стержню или прародитель, как государство, которое является весьма пролиферативного. Было показано , что эти клетки не являются онкогенными и не обладают способностью образовывать тератомы 23, 24. Кроме того, нетхромосомные аномалии или генетических манипуляций присутствовали после пересева этих клеток в культуре с помощью этой техники 23, 24. Самое главное, что эти клетки только способны дифференцироваться в собственный тип клеток, представляющих интерес. Таким образом, эта методика предлагает большой резервуар конкретного пациента эпителиальных клеток для исследования болезни или тканевой инженерии без необходимости в иммортализации.
Получение эпителиальной ткани от конкретного органа с целью изучения процессов болезни часто ограничена и не всегда возможно из-за риска пациента. Для тех пациентов, страдающих от болезни пищевода или дефектов, извлечение эндоскопическая биопсия является минимально инвазивной подход для получения эпителиальной ткани, которая может быть отделено и условно перепрограммировать, чтобы обеспечить неопределенный источник клеток, который является специфическим для слизистой оболочки пищевода, который пациента. Затем это позволяет для исследований в пробиркеэпителиальных клеток для оценки процессов, заболеваний и экран для потенциальных терапевтических средств. Один процесс болезни , которые могли бы извлечь большую пользу от этого подхода является то, эозинофильный эзофагит, которая была описана как аллергическое заболевание пищевода 8. Тесты аллергии, а также терапевтические подходы могут быть оценены в пробирке , используя собственные эпителиальные клетки пациента , и эти данные затем могут быть переданы на лечащего врача для разработки индивидуальных планов лечения. Методика условного перепрограммирования в сочетании с получением эндоскопических биопсий из педиатрической предлагает возможность расширить нормальные эпителиальные клетки пищевода на неопределенное время из любого пациента. Таким образом, этот источник клеток может быть совместно вместе с натуральным или синтетическим подмостей для обеспечения конкретного пациента хирургической манипуляции на наличие дефектов, болезни или травмы. Имея неограниченное число клеток поможет спроектировать пищеводу конструкции, которые обладают совершенно пересевалилюмена с пищеводной эпителиальными клетками, с тем чтобы помочь облегчить регенерацию остальных типов клеток.
Protocol
Representative Results
Discussion
Наиболее важные шаги для того, чтобы изолировать и расширить пищеводу эпителиальные клетки из биопсий пациентов являются: 1) адекватно отделяя биопсии ткани с минимальной клеточной гибели; 2) обеспечить ингибитор ROCK добавляют в среду для культивирования клеток при каждом изменении сре…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to acknowledge Connecticut Children’s Medical Center Strategic Research Funding for supporting this work.
Materials
| Primocin | InVivogen | ant-pm2 | |
| Isopentane | Sigma Aldrich | 277258-1L | |
| Gelatin From Porcine Skin | Sigma Aldrich | G1890-100G | |
| DMEM | Thermofisher Scientific | 11965092 | |
| Cryomold | TissueTek | 4565 | |
| Cryomatrix OCT | Thermofisher Scientific | 6769006 | |
| 15ml Conical Tubes | Denville Scientific | C1017-p | |
| Complete Keratinocyte Serum Free Medium | Thermofisher Scientific | 10724011 | |
| Penicillin Streptomycin | Thermofisher Scientific | 15140122 | |
| Glutamax | Thermofisher Scientific | 35050061 | |
| Insulin Solution | Sigma Aldrich | I9278-5ml | |
| Human Epidermal Growth Factor (EGF) | Peprotech | AF-100-15 | |
| ROCK Inhibitor (Y-27632) | Fisher Scientific | 125410 | |
| F-12 Medium | Thermofisher Scientific | 11765054 | |
| Fetal Bovine Serum | Denville Scientific | FB5001 | |
| Dispase | Thermofisher Scientific | 17105041 | |
| 0.05% Trypsin-EDTA | Thermofisher Scientific | 25300062 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Thermofisher Scientific | 25200072 | |
| 100mm Dishes | Denville Scientific | T1110-20 | |
| 150mm Dishes | Denville Scientific | T1115 | |
| 50ml Conicals | Denville Scientific | C1062-9 | |
| Phosphate Buffered Saline Tablets | Fisher Scientific | BP2944-100 | |
| 5ml Pipettes | Fisher Scientific | 1367811D | |
| 10ml Pipettes | Fisher Scientific | 1367811E | |
| 25ml Pipettes | Fisher Scientific | 1367811 | |
| 9" Pasteur Pipettes | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| NIH 3T3 Cells | ATCC | CRL1658 |
Riferimenti
- Clark, D. C. Esophageal atresia and tracheoesophageal fistula. Am Fam Physician. 59 (4), 910-920 (1999).
- Soon, I. S., Butzner, J. D., Kaplan, G. G., deBruyn, J. C. Incidence and prevalence of eosinophilic esophagitis in children. J Pediatr Gastroenterol Nutr. 57 (1), 72-80 (2013).
- Sjöqvist, S., et al. Experimental orthotopic transplantation of a tissue-engineered oesophagus in rats. Nat Commun. 5, 3562 (2014).
- Saxena, A. K. Esophagus tissue engineering: designing and crafting the components for the ‘hybrid construct’ approach. Eur J Pediatr Surg. 24 (3), 246-262 (2014).
- Saxena, A. K., Ainoedhofer, H., Höllwarth, M. E. Culture of ovine esophageal epithelial cells and in vitro esophagus tissue engineering. Tissue Eng Part C Methods. 16 (1), 109-114 (2010).
- Saxena, A. K., Kofler, K., Ainodhofer, H., Hollwarth, M. E. Esophagus tissue engineering: hybrid approach with esophageal epithelium and unidirectional smooth muscle tissue component generation in vitro. J Gastrointest Surg. 13 (6), 1037-1043 (2009).
- Macheiner, T., Kuess, A., Dye, J., Saxena, A. K. A novel method for isolation of epithelial cells from ovine esophagus for tissue engineering. Biomed Mater Eng. 24 (2), 1457-1468 (2014).
- Mishra, A. Significance of Mouse Models in Dissecting the Mechanism of Human Eosinophilic Gastrointestinal Diseases (EGID). J Gastroenterol Hepatol Res. 2 (11), 845-853 (2013).
- Medvedev, S. P., Shevchenko, A. I., Zakian, S. M. Induced Pluripotent Stem Cells: Problems and Advantages when Applying them in Regenerative Medicine. Acta Naturae. 2 (2), 18-28 (2010).
- Metallo, C. M., Azarin, S. M., Ji, L., de Pablo, J. J., Palecek, S. P. Engineering tissue from human embryonic stem cells. J Cell Mol Med. 12 (3), 709-729 (2008).
- Lee, H., Park, J., Forget, B. G., Gaines, P. Induced pluripotent stem cells in regenerative medicine: an argument for continued research on human embryonic stem cells. Regen Med. 4 (5), 759-769 (2009).
- Ghaedi, M., et al. Human iPS cell-derived alveolar epithelium repopulates lung extracellular matrix. J Clin Invest. 123 (11), 4950-4962 (2013).
- Huang, S. X., et al. Efficient generation of lung and airway epithelial cells from human pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. , (2013).
- Ogaki, S., Morooka, M., Otera, K., Kume, S. A cost-effective system for differentiation of intestinal epithelium from human induced pluripotent stem cells. Sci Rep. 5, 17297 (2015).
- Ehrhardt, C., Kim, K. J., Lehr, C. M. Isolation and culture of human alveolar epithelial cells. Methods Mol Med. 107, 207-216 (2005).
- Zubeldia-Plazaola, A., et al. Comparison of methods for the isolation of human breast epithelial and myoepithelial cells. Front Cell Dev Biol. 3, 32 (2015).
- Spurrier, R. G., Speer, A. L., Hou, X., El-Nachef, W. N., Grikscheit, T. C. Murine and human tissue-engineered esophagus form from sufficient stem/progenitor cells and do not require microdesigned biomaterials. Tissue Eng Part A. 21 (5-6), 906-915 (2015).
- Roche, J. K. Isolation of a purified epithelial cell population from human colon. Methods Mol Med. 50, 15-20 (2001).
- Southgate, J., Hutton, K. A., Thomas, D. F., Trejdosiewicz, L. K. Normal human urothelial cells in vitro: proliferation and induction of stratification. Lab Invest. 71 (4), 583-594 (1994).
- Kalabis, J., et al. Isolation and characterization of mouse and human esophageal epithelial cells in 3D organotypic culture. Nat Protoc. 7 (2), 235-246 (2012).
- Geraghty, R. J., et al. Guidelines for the use of cell lines in biomedical research. Br J Cancer. 111 (6), 1021-1046 (2014).
- Lodish, H., Berk, A., Zipursky, S. L., et al. . Molecular Cell Biology. , (2000).
- Liu, X., et al. ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells. Am J Pathol. 180 (2), 599-607 (2012).
- Suprynowicz, F. A., et al. Conditionally reprogrammed cells represent a stem-like state of adult epithelial cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (49), 20035-20040 (2012).
- Davis, A. A., et al. A human retinal pigment epithelial cell line that retains epithelial characteristics after prolonged culture. Invest Ophthalmol Vis Sci. 36 (5), 955-964 (1995).
- Carro, O. M., Evans, S. A., Leone, C. W. Effect of inflammation on the proliferation of human gingival epithelial cells in vitro. J Periodontol. 68 (11), 1070-1075 (1997).
