Qui, un campione di muscolo quadricipite viene prelevato da un maiale anestetizzato e i mitocondri vengono isolati mediante centrifugazione differenziale. Quindi, le frequenze respiratorie dei complessi della catena respiratoria mitocondriale I, II e IV vengono determinate utilizzando la respirometria ad alta risoluzione.
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Articolo metodologico
L'isolamento di mitocondri intatti dal muscolo scheletrico mediante centrifugazione differenziale per alta risoluzione respirometria Misure
In questo articolo
Sommario
Abstract
I mitocondri sono coinvolti nel metabolismo energetico cellulare e utilizzano l'ossigeno per produrre energia sotto forma di adenosina trifosfato (ATP). La centrifugazione differenziale a bassa e alta velocità è comunemente utilizzata per isolare i mitocondri dai tessuti e dalle cellule in coltura. Le frazioni mitocondriali grezze ottenute mediante centrifugazione differenziale vengono utilizzate per le misure di respirometria. La tecnica della centrifugazione differenziale si basa sulla separazione degli organelli in base alle loro dimensioni e velocità di sedimentazione. L'isolamento dei mitocondri viene eseguito immediatamente dopo il prelievo dei tessuti. Il tessuto viene immerso in un mezzo di omogeneizzazione ghiacciato, tritato con le forbici e omogeneizzato in un omogeneizzatore di vetro con un pestello largo. La tecnica di centrifugazione differenziale è efficiente, veloce ed economica e i mitocondri ottenuti con la centrifugazione differenziale sono sufficientemente puri per i saggi di respirometria. Alcuni dei limiti e degli svantaggi dei mitocondri isolati, basati sulla centrifugazione differenziale, sono che i mitocondri possono essere danneggiati durante la procedura di omogeneizzazione e isolamento e che per l'isolamento mitocondriale sono necessarie grandi quantità di biopsia tissutale o cellule in coltura.
Introduzione
bioenergetica mitocondriale e le capacità respiratorie possono essere studiate non solo nelle cellule o fibre permeabilizzate ma anche nei mitocondri isolati. Nel presente studio, si descrive un protocollo per isolare intatte mitocondri dei muscoli scheletrici con centrifugazione differenziale per misure respirometria ad alta risoluzione.
Per isolare mitocondri intatti per respirometria, il tessuto è omogeneizzata e mitocondri sono isolati mediante un metodo differenziale centrifugazione convenzionale. Il metodo differenziale centrifugazione si basa su centrifugazioni sequenziali (in una serie di aumentare la velocità) di omogenati di tes....
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Protocollo
La biopsia muscolo quadricipite viene prelevata da un suino anestetizzato, da cui i mitocondri sono isolate mediante centrifugazione differenziale. Il maiale viene utilizzata in seguito per un altro esperimento. Lo studio è effettuata in conformità con le linee guida del National Institutes of Salute per la cura e l'uso di animali da esperimento e con l'approvazione del Comitato cura degli animali del Canton Berna, Svizzera.
1. Omogeneizzazione muscolo scheletrico e isolamento mitocondriale
- Excise 5-10 esemplare g muscolo quadricipite da un maiale anestetizzato. Nel presente saggio, usare muscolo scheletrico sui....
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Risultati
Complesso I-dipendente respirazione
Isolati tassi mitocondriali complessi I dipendenti delle vie respiratorie (stati 2, 3 e 4) sono determinati utilizzando ad alta risoluzione respirometria (figura 1, un diagramma rappresentante). Mitocondriali substrati del complesso I, glutammato e malato, vengono aggiunti seguiti con l'aggiunta di ADP. Stato 2 si riferisce al consumo di ossigeno in pres.......
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Discussione
Nel presente studio si descrive un protocollo per isolare alta qualità, intatta e strettamente accoppiati mitocondri muscolari scheletriche mediante centrifugazione differenziale che possono essere utilizzati per gli studi funzionali come ad alta risoluzione respirometria.
Per isolare mitocondri intatti e strettamente accoppiati, ci sono alcuni punti critici da considerare all'interno del presente protocollo. Dopo la raccolta del tessuto scheletrico, va subito immerso in tampone isolamen.......
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Dichiarazioni
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Ringraziamenti
Questo studio è stato sostenuto dal Fondo Nazionale Svizzero per la Ricerca Scientifica (Grant 32003B_127619).
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Materiali
| Nome | Azienda | Numero di catalogo | Commenti |
|---|---|---|---|
| ADP | Sigma | A 4386 | Chimico |
| Antimicina A | Sigma | A 8674 | Chimico, sciogliere in etanolo |
| Ascorbato | Merck | 1.00127 | Chimico |
| ATP | Sigma | A 7699 | Chimico |
| BSA | Sigma | A 6003 | Chimico |
| EGTA | fluka | 3779 | Chimico |
| Glutammato | Sigma,G | 1626 | Chimico |
| Hepes | Sigma | H 7523 | Chimico |
| KCl | Merck | 1.04936 | Chimico |
| KH2PO4 | Merck | 1.04873 | Chimico |
| K-lattobionato | Sigma | L 2398 | |
| Chimico MgCl2 | Sigma | M 9272 | Acido |
| morfolinopropano solfonico chimico (MOPS) | Merck | 1.06129 | |
| O2k-Core chimico: ossigrafo-2k | Oroboros Instruments | 10000-02 | Strumento per respirometria ad alta risoluzione |
| Proteinasi, batterica | Sigma | P 8038 | Chimico |
| Sodio azide | Sigma | S2002 | Chimico |
| Rotenone | Sigma | R 8875 | Chimico, sciogliere in etanolo |
| Succinato | Sigma | S 2378 | Chimico |
| Schuett omogen-plus omogeneizzatore semiautomatico | schuett-biotec GmbH | 3.201 011 | Omogeneizzatore tissutale |
| Taurina | Sigma | T 8691 | Chimico |
| TMPD | Sigma | T 3134 | Chimico |
Riferimenti
- Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. Cytochemical studies of mammalian tissues. I. Isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material. J. Biol. Chem. 172, 619-635 (1948).
- Sims, N. R.
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Ristampe e permessi
