Kartläggning av RNA-RNA-interaktioner globalt med användning av biotinylerad psoralen

Summary

Här specificerar vi metoden för S- ekventering av P- sorolen tvärbunden, L igaterad och S väljs H ybrids (SPLASH), som möjliggör genomgående kartläggning av intramolekylära och intermolekylära RNA-RNA-interaktioner in vivo . SPLASH kan appliceras för att studera RNA-interaktomer av organismer inklusive jäst, bakterier och människor.

Abstract

Att veta hur RNA interagerar med sig själva och med andra är nyckeln till förståelsen av RNA-baserad genreglering i cellen. Även om exempel på RNA-RNA-interaktioner såsom mikroRNA-mRNA-interaktioner har visat sig reglera genuttryck, är den fullständiga utsträckning som RNA-interaktioner uppträder i cellen fortfarande okänd. Tidigare metoder för att studera RNA-interaktioner har huvudsakligen fokuserat på delmängder av RNA som interagerar med ett visst protein eller RNA-art. Här specificerar vi en metod som heter S- ekventering av P soralen tvärbunden, L igaterad och S valda H ybrids (SPLASH) som möjliggör genomgripande infångning av RNA-interaktioner in vivo på ett opartiskt sätt. SPLASH använder in vivo tvärbindning, närhetligering och hög genomströmningssekvensering för att identifiera intramolekylära och intermolekylära RNA-basparparametrar globalt. SPLASH kan appliceras på olika organismer inklusive bakterier, jäst och mänskliga celler, liksom aS olika cellulära förhållanden för att underlätta förståelsen av RNA-organisationens dynamik under olika cellulära sammanhang. Hela experimentella SPLASH-protokollet tar ungefär 5 dagar att slutföra och beräkningsflödet tar ungefär 7 dagar att slutföra.

Introduction

Att studera hur makromolekyler viks och interagerar med varandra är nyckeln till att förstå genreglering i cellen. Medan mycket arbete har fokuserats under det senaste decenniet om att förstå hur DNA och proteiner bidrar till genreglering, är relativt mindre känt om post-transkriptionell reglering av genuttryck. RNA bär information i både sin linjära sekvens och i dess sekundära och tertiära struktur ¹ . Dess förmåga att basera paret med sig själv och med andra är viktigt för sin funktion in vivo . Nyliga framsteg inom RNA-sekundärstrukturundersökning med hög genomströmning har givit värdefulla insikter i placeringen av dubbel- och enkelsträngade regioner i transkriptomen ^{2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8} , howeVer information om parningsparametrarna saknas fortfarande i stor utsträckning. För att bestämma vilken RNA-sekvens som interagerar med en annan RNA-region i transkriptomen behöver vi global parvis information.

Kartläggning av parvisa RNA-interaktioner på ett globalt, opartiskt sätt har traditionellt varit en stor utmaning. Medan tidigare tillvägagångssätt, såsom CLASH ⁹ , hiCLIP ¹⁰ och RAP ¹¹ , används för att identifiera RNA-interaktioner i stor skala, kartlägger dessa tekniker typiskt RNA-basparning för en delmängd av RNA som antingen interagerar med ett visst protein eller RNA-species. Den senaste utvecklingen i studier av globala RNA-interaktioner inkluderar metoden RPL ¹² , som inte stabiliserar RNA-interaktioner in vivo och kan därför endast fånga en delmängd av in vivo- interaktioner. För att övervinna dessa utmaningar utvecklade vi och andra genomgående, opartiska strategier för maP RNA-interaktomer in vivo , med användning av modifierade versioner av tvärbindningspsoralen ^{13 , 14 , 15} . I detta protokoll beskriver vi detaljerna för utförande av S- ekventering av P- soralt tvärbunden, L- igaterad och S valda H ybrids (SPLASH), vilken utnyttjar biotinylerad psoralen för att tvärbinda basparrings-RNA in vivo följt av närliggande ligering och hög genomströmningssekvensering till Identifiera RNA-basparparametrar genomgående ( Figur 1 ) ¹⁵ .

I det här manuskriptet beskriver vi stegen för att utföra SPLASH med hjälp av odlade vidhäftande celler, i detta fall HeLa-celler. Samma protokoll kan lätt anpassas till suspensionsdäggdjursceller och till jäst- och bakterieceller. I korthet behandlas HeLa-celler med biotinylerad psoralen och bestrålas vid 365 nm för att tvärbinda interaktiva RNA-baspar in vivo. RNA: erna extraheras sedan från cellerna, fragmenteras och berikas för tvärbindningsregioner med användning av streptavidinpärlor. Interaktiva RNA-fragment ligeras sedan tillsammans med användning av närliggande ligering och gjordes i ett cDNA-bibliotek för djup sekventering. Vid sekvensering mappas de chimära RNA på transcriptomen / genomet för att identifiera de RNA-interagerande regionerna som är parade med varandra. Vi har framgångsrikt utnyttjat SPLASH för att identifiera tusentals RNA-interaktioner in vivo i jäst och olika humana celler, inklusive intramolekylär och intermolekylär RNA-basparning i olika klasser av RNA, såsom snoRNA, lncRNA och mRNA, för att glimta in i strukturorganisationen och interaktionsmönstren Av RNA i cellen.

Protocol

1. Behandling av HeLa-celler med biotinylerad psoralen och RNA-extraktion Culture HeLa-celler i Dulbeccos modifierade Eagle-medium (DMEM) kompletterat med 10% fetalt bovinserum (FBS) och 1% penicillin streptomycin (PS) i en 10 cm-platta. Tvätta HeLa-cellerna två gånger med 5 ml 1x PBS. Tappa överskott av PBS helt ur skålen genom att placera skålen vertikalt i 1 min. Tillsätt 1 ml PBS innehållande 200 μM biotinylerad psoralen och 0,01% vikt / volym digitonin, till cellerna jämnt o…

Representative Results

Figur 1 visar schematisk av SPLASH-arbetsflödet. Vid tillsats av biotinylerad psoralen i närvaro av 0,01% digitonin och UV-tvärbindning extraheras totalt RNA från cellerna och en punktfläck utförs för att säkerställa att tvärbindning av biotinylerad till RNA har skett effektivt ( Figur 2 ). Vi använder biotinylerade 20 basoligoser som positiva kontroller för att titrera mängden biotinylerad psoralen som skall sätta…

Discussion

Här beskriver vi i detalj det experimentella och beräknade arbetsflödet för SPLASH, en metod som gör det möjligt för oss att identifiera parvisa RNA-interaktioner på ett genomgående sätt. Vi har framgångsrikt utnyttjat SPLASH i bakteriella, jäst- och mänskliga kulturer och förutse att strategin kan tillämpas allmänt på olika organismer under olika cellulära tillstånd. Ett av de kritiska stegen i protokollet är att börja med minst 20 | jg tvärbunden RNA för att ha tillräckligt material för nedstr…

Materials

1 Kb Plus DNA Ladder	Life Technologies Holdings Pte Ltd	10787026	DNA ladder
10 bp DNA ladder	Life Technologies Holdings Pte Ltd	10821-015	DNA ladder
20 % SDS solution	First BASE	BUF-2052-1L
20x SSC	First BASE	BUF-3050-20X1L
3.0 M Sodium Acetate Solution	First BASE	BUF-1151-1L-pH5.2	Required for nucleic acid precipitation
40% Acrylamide/Bis Solution, 19:1	Bio-Rad	1610145	TBE Urea gel component
Ambion Buffer Kit	Life Technologies Holdings Pte Ltd	AM9010
Ammonium Persulfate, Molecular Grade	Promega	V3131	TBE Urea gel component
Bromophenol Blue	Sigma-Aldrich	B0126-25G
Chloroform	Merck	1.02445.1000	RNA extraction
Single strand DNA ligase	Epicentre	CL9025K	CircLigase II ssDNA Ligase
Centrifuge tube filters	Sigma-Aldrich	CLS8160-96EA	Costar Spin-X centrifuge tube filters
D5628-1G DIGITONIN CRYSTALLINE	Sigma-Aldrich	D5628-1G	For cell treatment
Dark Reader Transilluminator	Clare Chemical Research	Dark Reader DR89X Transilluminator	Blue light transilluminator
DNA Gel Loading Dye (6X)	Life Technologies Holdings Pte Ltd	R0611	Required for agarose gel electroporation
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Pan BioTech	P04-03500	For Hela cell culture
Streptavidin magnetic beads	Life Technologies Holdings Pte Ltd	65002	Dynabeads MyOne Streptavidin C1
Magnetic stand for 15ml tubes	Life Technologies Holdings Pte Ltd	12301D	DynaMag-15
Magnetic stand for 15ml tubes	Life Technologies Holdings Pte Ltd	12321D	DynaMag-2
ThermoMixer	Eppendorf	5382 000.015	Eppendorf ThermoMixer C
Biotinylated psoralen	Life Technologies Holdings Pte Ltd	29986	EZ-Link Psoralen-PEG3-Biotin
F8T5/BL	Hitachi	F8T5/BL	365 nm UV bulb
Fetal Bovine Serum	Life Technologies Holdings Pte Ltd	10270106	Components of Hela medium
Formamide	Promega	H5052	Component in hybridization buffer
G8T5	Sankyo-Denki	G8T5	254 nm UV bulb
Glycogen	Life Technologies Holdings Pte Ltd	10814010	Required for nucleic acid precipitation
Nanodrop	Life Technologies Holdings Pte Ltd	Nanodrop 2000	Spectrophotometer for nucleic acidquantification
Nuclease free water	First BASE	BUF-1180-500ml
Penicillin Streptomycin	Life Technologies Holdings Pte Ltd	15140122	Components of Hela medium
High-Fidelity DNA polymerase (2x)	Life Technologies Holdings Pte Ltd	F531L	Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer (2x)
Primers Set 1	New England Biolabs	E7335L	PCR primers
DNA Gel Extraction Kit	QIAgen	28106	QIAquick Gel Extraction Kit
Fluorometric Quantification kit	Life Technologies Holdings Pte Ltd	Q32854	Qubit dsDNA HS Assay Kit
RNA clean up kit	Qiagen	74106	RNeasy Mini Kit Silica-membrane column
Rnase Inhibitor	Life Technologies Holdings Pte Ltd	AM2696	SUPERase In
Reverse transcriptase	Life Technologies Holdings Pte Ltd	18080400	SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix
Nucleic Acid Gel Stain	Life Technologies Holdings Pte Ltd	S11494	SYBR GOLD NUCLEIC ACID 500 UL
T4 Polynucleotide Kinase	New England Biolabs	M0201L	End repair enzyme
T4 RNA Ligase 1	New England Biolabs	M0204L	Enzyme for proximity ligation
T4 RNA Ligase 2, truncated KQ	New England Biolabs	M0373L	Enzyme for adaptor ligation
Temed	Bio-Rad	1610801	TBE Urea gel component
Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform	Life Technologies Holdings Pte Ltd	15596018	TRIzol® Reagent for RNA extraction
Urea	First BASE	BIO-2070-5kg
UV crosslinker	Stratagene	400072	UV Stratalinker 1800
UV Transilluminator	UVP	95-0417-01	For visualizing of bands
Xylene Cyanol FF	Sigma-Aldrich	X4126-10G
DNA cleanup it	Zymo Research	D4004	Zymo DNA concentrator-5
List of software required
FastQC software	0.11.4	http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/
SeqPrep software	1.0.7	https://github.com/jstjohn/SeqPrep
BWA software	0.7.12	http://bio-bwa.sourceforge.net/
SAMTOOLS software	1.2.1	http://www.htslib.org/
PULLSEQ software	1.0.2	https://github.com/bcthomas/pullseq
STAR software	2.5.0c	https://github.com/alexdobin/STAR
rem_dups.py PYTHON script	PYTHON 2.7.11	https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
find_chimeras.py PYTHON script	PYTHON 2.7.11	https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
pickJunctionReads.awk AWK script	AWK GNU 4.1.2	https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
Buffer composition
Elution buffer:
0.3 M sodium acetate
Lysis Buffer:
50 mM Tris-Cl pH 7.0
10 mM EDTA
1% SDS
Always add Superase-in fresh before use except when washing beads
Proteinase K Buffer
100 mM NaCl
10 mM TrisCl pH 7.0
1 mM EDTA
0.5% SDS
Hybridization Buffer
750 mM NaCl
1% SDS
50 mM Tris-Cl pH 7.0
1 mM EDTA
15% formamide (store in the dark at 4 °C)
Always add Superase-in fresh before use
2x SSC Wash Buffer
2x NaCl and Sodium citrate (SSC) (diluted from 20x SSC Invitrogen stock)
0.5% SDS
2X RNA fragmentation buffer
18mM MgCl2
450mM KCl
300mM Tris-CL pH 8.3
2x RNA loading Dye:
95% Formamide
0.02% SDS
0.02% bromophenol blue
0.01% Xylene Cyanol
1mM EDTA
3' RNA adapter sequence	5rAppCTGTAGGCACCATCAAT/3ddC
RT primer sequence	AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGC/iSp18/CACTCA/iSp18/TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTATTGATGGTGCCTACAG