Mappatura delle interazioni RNA-RNA globalmente utilizzando Psoralen biotinilato

Summary

Qui, abbiamo dettagliato il metodo di equilibrio di P soralen crosslinked, L igated e S elected H ybrids (SPLASH), che consente mapping a livello genomico delle interazioni RNA-RNA intramolecolari e intermolecolari in vivo . SPLASH può essere applicato per studiare interagenti RNA di organismi compresi lieviti, batteri e umani.

Abstract

Sapere come i RNA interagiscono con se stessi e con gli altri è fondamentale per capire la regolazione del gene basato su RNA nella cellula. Mentre esempi di interazioni RNA-RNA come le interazioni di microRNA-mRNA sono state dimostrate per regolare l'espressione genica, l'intero grado in cui si verificano interazioni RNA nella cella è ancora sconosciuto. I metodi precedenti per studiare le interazioni di RNA si sono concentrati principalmente su subsets di RNA che interagiscono con una particolare proteina o specie di RNA. Qui, abbiamo dettagliato un metodo denominato S equencing di P soralen crosslinked, L igated, e S eletti H ybrids (SPLASH) che consente la cattura genoma di interazioni RNA in vivo in modo imparziale. SPLASH utilizza la reticolazione in vivo , la legatura di prossimità e il sequenziamento ad alta velocità per identificare partner globalmente associati alla base di RNA intramolecolare e intermolecolare. SPLASH può essere applicato a diversi organismi, compresi batteri, lieviti e cellule umane, nonché aS diverse condizioni cellulari per facilitare la comprensione della dinamica dell'organizzazione di RNA in diversi contesti cellulari. L'intero protocollo sperimentale SPLASH richiede circa 5 giorni per completare e il flusso di lavoro computazionale richiede circa 7 giorni per completare.

Introduction

Studiare come macromolecole si piegano e interagiscono tra loro è la chiave per comprendere la regolazione del gene nella cellula. Mentre molti sforzi sono stati focalizzati nell'ultimo decennio per comprendere come il DNA e le proteine ​​contribuiscono alla regolazione del gene, è relativamente meno noto circa la regolazione post-trascrizionale dell'espressione genica. L'RNA trasporta informazioni sia nella sequenza lineare che nella struttura secondaria e terziaria ¹ . La sua capacità di fondare la coppia con se stessa e con gli altri è importante per la sua funzione in vivo . I progressi recenti nel sondaggio della stru....

Protocol

1. Trattamento delle cellule HeLa con estrazione di Psoralen e RNA biotinilata

1. Coltivano le cellule HeLa nel mezzo di Eagle di Dulbecco (DMEM) integrato con 10% di siero fetale fetale (FBS) e 1% di penicillina streptomicina (PS) in una piastra di 10 cm.
2. Lavare le cellule HeLa due volte con 5 ml di 1x PBS. Scaricare completamente il PBS dal piatto posando il piatto verticalmente per 1 minuto.
3. Aggiungere 1 ml di PBS contenente 200 μM di psoralene biotinilato e 0,01% w / v digitonin, alle cellule uniformemente e incubare a 37 ° C per 5 min. Mentre il psoralen biotinilato può entrare nella cella, la sua permeabilità è molto più alta quando ....

Results

La figura 1 rappresenta lo schema del flusso di lavoro SPLASH. Dopo l'aggiunta di psoralene biotinilato in presenza di 0,01% di digitonina e di reticolazione UV, viene estratto un totale di RNA dalle cellule e viene eseguita una macchia di punti per assicurare che il collegamento a biotinilato con l'RNA sia accaduto in modo efficace ( Figura 2 ). Utilizziamo oligosini biotinilati 20 come controlli positivi per titolare la quanti.......

Discussion

Qui descriviamo in dettaglio il flusso di lavoro sperimentale e computazionale per SPLASH, un metodo che ci permette di identificare le interazioni RNA a due mani in modo genico-wide. Abbiamo utilizzato con successo SPLASH nelle colture batteriche, lieviti e umane e anticipo che la strategia possa essere ampiamente applicata a organismi diversi in diversi stati cellulari. Uno dei passaggi critici del protocollo è quello di iniziare con almeno 20 μg di RNA reticolato per avere materiale adeguato per i processi a valle. L.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
1 kb Plus DNA Ladder	Life Technologies Holdings Pte Ltd	10787026	Scala
DNA 10 bp Scala DNA	Life Technologies Holdings Pte Ltd	10821-015	Scala DNA
20% Soluzione SDS	Prima BASE	BUF-2052-1L
20x SSC	First BASE	BUF-3050-20X1L
3.0 M Soluzione di acetato di sodio	First BASE	BUF-1151-1L-pH5.2	Necessario per la precipitazione degli acidi nucleici
Soluzione di acrilammide/bis al 40%, 19:1	Bio-Rad	1610145	TBE Componente in gel di urea
Kit tampone Ambion	Technologies Holdings Pte Ltd	AM9010
Persolfato di ammonio, grado molecolare	Promega	V3131	TBE Componente in gel di urea
Blu di bromofenolo	Sigma-Aldrich	B0126-25G
Cloroformio	Merck	1.02445.1000	Estrazione dell'RNA
DNA ligasi a filamento singolo	Epicentro	CL9025K	CircLigasi II ssDNA Ligasi
Filtri per provette da centrifuga	Sigma-Aldrich	CLS8160-96EA	Costar Spin-X filtri per provette
D5628-1G DIGITONIN CRYSTALLINE	Sigma-Aldrich	D5628-1G	Per il trattamento cellulare
Dark Reader Transilluminator	Clare Chemical Research	Dark Reader DR89X Transilluminatore	luce blu Transilluminatore
DNA Gel Caricamento colorante (6x)	Life Technologies Holdings Pte Ltd	R0611	Necessario per l'elettroporazione su gel di agarosio
Dulbecco's Modified Eagle Medium Pan	BioTech	P04-03500	Per colture cellulari Hela
Perle magnetiche di streptavidina	Life Technologies Holdings Pte Ltd	65002	Dynabeads MyOne Streptavidina C1
Supporto magnetico per 15  mL tubi	Life Technologies Holdings Pte Ltd	12301D	DynaMag-15
Supporto magnetico per 15  provette da ml	Life Technologies Holdings Pte Ltd	12321D	DynaMag-2
ThermoMixer	Eppendorf	5382 000.015	Eppendorf ThermoMixer  C
Psoralene biotinilato	Life Technologies Holdings Pte Ltd	29986	EZ-Link Psoralen-PEG3-Biotina
F8T5/BL	Hitachi	F8T5/BL	Lampadina UV da 365 nm
Fetale Siero Bovino Life Technologies	Holdings Pte Ltd	10270106	Componenti di Hela medium
Formamide	Promega	H5052	Componente nel buffer di ibridazione
G8T5	Sankyo-Denki	G8T5	254 nm Lampadina UV
Glycogen	Life Technologies Holdings Pte Ltd	10814010	Necessario per la precipitazione dell'acido nucleico
Nanodrop	Life Technologies Holdings Pte Ltd	Spettrofotometro Nanodrop 2000	per la quantificazione dell'acido nucleico
Acqua priva di nucleasi	Prima BASE	BUF-1180-500ml
Penicillina Streptomicina	Life Technologies Holdings Pte Ltd	15140122	Componenti di Hela medium
DNA polimerasi ad alta fedeltà (2x)	Life Technologies Holdings Pte Ltd	F531L	Phusion Master Mix PCR ad alta fedeltà con tampone HF (2x)
Set di primer 1	New England Biolabs	E7335L	Primer per PCR
Kit di estrazione del gel di DNA	QIAgen	28106	Kit di estrazione del gel QIAquick
Kit di quantificazione fluorimetrica	Life Technologies Holdings Pte Ltd	Q32854	Qubit dsKit di analisi HS
Kit di pulizia dell'RNA	Qiagen	74106	RNeasy Mini Kit Colonna della membrana di silice
Inibitore della RNasi	Life Technologies Holdings Pte Ltd	AM2696	SUPERase In
Trascrittasi inversa	Life Technologies Holdings Pte Ltd	18080400	SuperScript III Sintesi del primo filamento SuperMix
Gel di acido nucleico Colorazione	Life Technologies Holdings Pte Ltd	S11494	SYBR GOLD ACIDO NUCLEICO 500 UL
T4 Polinucleotide chinasi	New England Biolabs	M0201L	Enzima di riparazione finale
T4 RNA Ligasi 1	New England Biolabs	M0204L	Enzima per legatura di prossimità
T4 RNA Ligasi 2, troncato KQ	New England Biolabs	M0373L	Enzima per la legatura dell'adattatore
Temed	Bio-Rad	1610801	TBE Componente in gel di urea
Guanidinium tiocianato-fenolo-cloroformio	Life Technologies Holdings Pte Ltd	15596018	TRIzol® Reagente per estrazione RNA
Urea	First BASE	BIO-2070-5kg
Reticolante UV	Stratagene	400072	UV Stratalinker 1800
Transilluminatore UV	UVP	95-0417-01	Per la visualizzazione delle
bande Xilene Cyanol FF	Sigma-Aldrich	X4126-10G
Pulizia del DNA Zymo	Research	D4004	Concentratore di DNA Zymo-5
Elenco dei software richiesti
Software FastQC	0.11.4	Software http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/
SeqPrep	1.0.7	https://github.com/jstjohn/SeqPrep
Software BWA	0.7.12	Software http://bio-bwa.sourceforge.net/
SAMTOOLS	1.2.1	http://www.htslib.org/
PULLSEQ software	1.0.2	https://github.com/bcthomas/pullseq
STAR software	2.5.0c	https://github.com/alexdobin/STAR
rem_dups.py script PYTHON PYTHON	2.7.11	https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
find_chimeras.py script PYTHON	2.7.11
pickJunctionReads.awk Script AWK AWK	GNU 4.1.2	https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
Composizione del buffer
Tampone di eluizione
0.3 M acetato
< strong>Lysis Buffer
50 mM Tris-Cl pH 7.0
10 mM EDTA
1% SDS
tranne quando si lavano perline
Proteinasi K Buffer
100 mM NaCl
10 mM Tris-Cl pH 7,0
1 mM EDTA
0,5% SDS
Tampone di ibridazione
750 mM NaCl
1% SDS
50 mM Tris-Cl pH 7,0
1 mM EDTA
15% formamide (conservare al buio a 4 ° C)
Aggiungere sempre Superase-in fresco prima dell'uso
2x SSC Wash Buffer
x NaCl e citrato di sodio (SSC) (diluito da 20x SSC Invitrogen stock)
0,5% SDS
2x RNA fragmentation buffer
18 mM MgCl2
450 mM KCl
300 mM Tris-Cl pH 8,3
2x caricamento dell'RNA Colorante
95% Formamide
0,02% SDS
0,02% blu
0,01% Xilene Cianolo
1 mM EDTA
RT sequenza di primer: AGATCGGAAGAGCGTGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGC/iSp18/CACTCA/iSp18/TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTATTGATGGTGCCTACAG