Mapeo de las interacciones RNA-ARN a nivel mundial usando Psoralen Biotinilado

Summary

Aquí, se detalla el método de S de equación de P soralen reticulado, L igated, y S elegido H ybrids (SPLASH), que permite el genoma de la cartografía de todo el intramolecular y intermolecular RNA-ARN interacciones in vivo . SPLASH puede ser aplicado para estudiar interactones de ARN de organismos incluyendo levaduras, bacterias y seres humanos.

Abstract

Saber cómo interactúan los ARN con ellos mismos y con otros es clave para entender la regulación de genes basada en ARN en la célula. Aunque se ha demostrado que los ejemplos de interacciones ARN-ARN, tales como las interacciones ARNm-ARNm, regulan la expresión génica, se desconoce hasta qué punto se producen las interacciones ARN en la célula. Los métodos anteriores para estudiar las interacciones de ARN se han centrado principalmente en subconjuntos de ARN que están interactuando con una proteína particular o especies de ARN. Aquí, detallamos un método llamado S de equación de P soralen reticulado, L igated, y S elegido H ybrids (SPLASH) que permite a todo el genoma de captura de ARN interacciones in vivo de manera imparcial. SPLASH utiliza reticulación in vivo , ligación de proximidad y secuenciación de alto rendimiento para identificar socios de unión de bases de ARN intramoleculares e intermoleculares a nivel mundial. SPLASH puede aplicarse a diferentes organismos, incluyendo bacterias, levaduras y células humanas,S diversas condiciones celulares para facilitar la comprensión de la dinámica de la organización del ARN en diversos contextos celulares. Todo el protocolo SPLASH experimental tarda aproximadamente 5 días en completarse y el flujo de trabajo computacional tarda aproximadamente 7 días en completarse.

Introduction

Estudiar cómo las macromoléculas se pliegan e interactúan entre sí es la clave para entender la regulación genética en la célula. Aunque se ha centrado mucho esfuerzo en la última década en la comprensión de cómo el ADN y las proteínas contribuyen a la regulación de genes, se sabe relativamente menos sobre la regulación post-transcripcional de la expresión génica. El ARN lleva información tanto en su secuencia lineal como en su estructura secundaria y terciaria ¹ . Su capacidad de base de pares con sí mismo y con otros es importante para su función in vivo . Los recientes avances en el sondaje de la estructura secundaria de ARN de alto rendimiento han proporcionado información valiosa sobre las ubicaciones de las regiones de doble y única hebra en el transcriptoma ^{2 , 3 , 4 , 5 , 6 , 7 , 8} , howeVer información sobre los compañeros de interacción de emparejamiento sigue siendo en gran parte falta. Para determinar qué secuencia de ARN está interactuando con otra región de ARN en el transcriptoma, necesitamos información global de pares.

Mapear las interacciones de ARN en pares de una manera global e imparcial ha sido tradicionalmente un desafío importante. Mientras que los enfoques anteriores, tales como CLASH ⁹ , hiCLIP ¹⁰ y RAP ¹¹ , se utilizan para identificar las interacciones de ARN a gran escala, estas técnicas típicamente mapa de ARN base de emparejamiento de un subconjunto de ARN que interactúan con una proteína particular o especies de ARN. Los desarrollos recientes en el estudio de las interacciones globales de ARN incluyen el método RPL ¹² , que no estabiliza las interacciones de ARN in vivo y, por tanto, sólo puede capturar un subconjunto de interacciones in vivo . Para superar estos desafíos, nosotros y otros desarrollamos estrategias genéticamenteP ARN interactomas in vivo , utilizando versiones modificadas del reticulador psoraleno ^{13 , 14 , 15} . En este protocolo, se describen los detalles para realizar S equación de P soralen reticulado, L igated, y S elegido Hybridos (SPLASH), que utiliza biotinylated psoraleno a la cruz de enlace de base RNAs in vivo , seguido por la ligación de proximidad y de alto rendimiento de secuenciación a Identificar ARN base de apareamiento asociados genoma en todo ( Figura 1 ] [ ^15] .

En este manuscrito, describimos los pasos para realizar SPLASH utilizando cultivos de células adherentes, en este caso las células HeLa. El mismo protocolo puede adaptarse fácilmente a las células de mamífero en suspensión ya las células de levadura y bacterias. En resumen, las células HeLa se tratan con psoraleno biotinilado y se irradian a 365 nm para reticular los pares de bases de ARN que interactúan in vivo. A continuación, los ARN se extraen de las células, se fragmentan y se enriquecen para reticular regiones usando esferas de estreptavidina. Los fragmentos de ARN que interactúan se ligan entonces juntos usando ligación de proximidad y se convierten en una biblioteca de cDNA para secuenciación profunda. Tras la secuenciación, los ARN quiméricos se asignan en el transcriptoma / genoma para identificar las regiones que interactúan con ARN que están emparejadas entre sí. Hemos utilizado exitosamente SPLASH para identificar miles de interacciones de ARN in vivo en levaduras y diferentes células humanas, incluyendo el emparejamiento de ARN intramolecular e intermolecular en diversas clases de ARNs, tales como snoRNAs, lncRNAs y mRNAs, para vislumbrar la organización estructural y los patrones de interacción De ARN en la célula.

Protocol

1. Tratamiento de las células HeLa con Bioralina y Extracción de ARN Biotiniladas Cultivo de células HeLa en medio Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina estreptomicina (PS) en una placa de 10 cm. Lavar las células HeLa dos veces con 5 mL de 1x PBS. Escurra el exceso de PBS completamente del plato colocando el plato verticalmente durante 1 minuto. Añadir 1 ml de PBS que contiene 200 μM de psoraleno biotinilado y 0,01% …

Representative Results

La figura 1 muestra el esquema del flujo de trabajo SPLASH. Tras la adición de psoraleno biotinilado en presencia de 0,01% de digitonina y reticulación UV, se extrae el ARN total de las células y se realiza una transferencia de puntos para asegurar que la reticulación del biotinilado al ARN se ha producido de manera eficiente ( Figura 2 ). Utilizamos oligos biotinilados de 20 bases como controles positivos para titular la ca…

Discussion

Aquí, describimos en detalle el flujo de trabajo experimental y computacional para SPLASH, un método que nos permite identificar par-wise RNA interacciones en un genoma de ancho manera. Hemos utilizado exitosamente SPLASH en bacterias, levaduras y cultivos humanos y anticipamos que la estrategia puede ser ampliamente aplicada a diversos organismos bajo diferentes estados celulares. Uno de los pasos críticos en el protocolo es comenzar con al menos 20 μg de ARN reticulado para tener material adecuado para los proceso…

Materials

1 Kb Plus DNA Ladder	Life Technologies Holdings Pte Ltd	10787026	DNA ladder
10 bp DNA ladder	Life Technologies Holdings Pte Ltd	10821-015	DNA ladder
20 % SDS solution	First BASE	BUF-2052-1L
20x SSC	First BASE	BUF-3050-20X1L
3.0 M Sodium Acetate Solution	First BASE	BUF-1151-1L-pH5.2	Required for nucleic acid precipitation
40% Acrylamide/Bis Solution, 19:1	Bio-Rad	1610145	TBE Urea gel component
Ambion Buffer Kit	Life Technologies Holdings Pte Ltd	AM9010
Ammonium Persulfate, Molecular Grade	Promega	V3131	TBE Urea gel component
Bromophenol Blue	Sigma-Aldrich	B0126-25G
Chloroform	Merck	1.02445.1000	RNA extraction
Single strand DNA ligase	Epicentre	CL9025K	CircLigase II ssDNA Ligase
Centrifuge tube filters	Sigma-Aldrich	CLS8160-96EA	Costar Spin-X centrifuge tube filters
D5628-1G DIGITONIN CRYSTALLINE	Sigma-Aldrich	D5628-1G	For cell treatment
Dark Reader Transilluminator	Clare Chemical Research	Dark Reader DR89X Transilluminator	Blue light transilluminator
DNA Gel Loading Dye (6X)	Life Technologies Holdings Pte Ltd	R0611	Required for agarose gel electroporation
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Pan BioTech	P04-03500	For Hela cell culture
Streptavidin magnetic beads	Life Technologies Holdings Pte Ltd	65002	Dynabeads MyOne Streptavidin C1
Magnetic stand for 15ml tubes	Life Technologies Holdings Pte Ltd	12301D	DynaMag-15
Magnetic stand for 15ml tubes	Life Technologies Holdings Pte Ltd	12321D	DynaMag-2
ThermoMixer	Eppendorf	5382 000.015	Eppendorf ThermoMixer C
Biotinylated psoralen	Life Technologies Holdings Pte Ltd	29986	EZ-Link Psoralen-PEG3-Biotin
F8T5/BL	Hitachi	F8T5/BL	365 nm UV bulb
Fetal Bovine Serum	Life Technologies Holdings Pte Ltd	10270106	Components of Hela medium
Formamide	Promega	H5052	Component in hybridization buffer
G8T5	Sankyo-Denki	G8T5	254 nm UV bulb
Glycogen	Life Technologies Holdings Pte Ltd	10814010	Required for nucleic acid precipitation
Nanodrop	Life Technologies Holdings Pte Ltd	Nanodrop 2000	Spectrophotometer for nucleic acidquantification
Nuclease free water	First BASE	BUF-1180-500ml
Penicillin Streptomycin	Life Technologies Holdings Pte Ltd	15140122	Components of Hela medium
High-Fidelity DNA polymerase (2x)	Life Technologies Holdings Pte Ltd	F531L	Phusion High-Fidelity PCR Master Mix with HF Buffer (2x)
Primers Set 1	New England Biolabs	E7335L	PCR primers
DNA Gel Extraction Kit	QIAgen	28106	QIAquick Gel Extraction Kit
Fluorometric Quantification kit	Life Technologies Holdings Pte Ltd	Q32854	Qubit dsDNA HS Assay Kit
RNA clean up kit	Qiagen	74106	RNeasy Mini Kit Silica-membrane column
Rnase Inhibitor	Life Technologies Holdings Pte Ltd	AM2696	SUPERase In
Reverse transcriptase	Life Technologies Holdings Pte Ltd	18080400	SuperScript III First-Strand Synthesis SuperMix
Nucleic Acid Gel Stain	Life Technologies Holdings Pte Ltd	S11494	SYBR GOLD NUCLEIC ACID 500 UL
T4 Polynucleotide Kinase	New England Biolabs	M0201L	End repair enzyme
T4 RNA Ligase 1	New England Biolabs	M0204L	Enzyme for proximity ligation
T4 RNA Ligase 2, truncated KQ	New England Biolabs	M0373L	Enzyme for adaptor ligation
Temed	Bio-Rad	1610801	TBE Urea gel component
Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform	Life Technologies Holdings Pte Ltd	15596018	TRIzol® Reagent for RNA extraction
Urea	First BASE	BIO-2070-5kg
UV crosslinker	Stratagene	400072	UV Stratalinker 1800
UV Transilluminator	UVP	95-0417-01	For visualizing of bands
Xylene Cyanol FF	Sigma-Aldrich	X4126-10G
DNA cleanup it	Zymo Research	D4004	Zymo DNA concentrator-5
List of software required
FastQC software	0.11.4	http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/
SeqPrep software	1.0.7	https://github.com/jstjohn/SeqPrep
BWA software	0.7.12	http://bio-bwa.sourceforge.net/
SAMTOOLS software	1.2.1	http://www.htslib.org/
PULLSEQ software	1.0.2	https://github.com/bcthomas/pullseq
STAR software	2.5.0c	https://github.com/alexdobin/STAR
rem_dups.py PYTHON script	PYTHON 2.7.11	https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
find_chimeras.py PYTHON script	PYTHON 2.7.11	https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
pickJunctionReads.awk AWK script	AWK GNU 4.1.2	https://github.com/CSB5/splash/tree/master/src
Buffer composition
Elution buffer:
0.3 M sodium acetate
Lysis Buffer:
50 mM Tris-Cl pH 7.0
10 mM EDTA
1% SDS
Always add Superase-in fresh before use except when washing beads
Proteinase K Buffer
100 mM NaCl
10 mM TrisCl pH 7.0
1 mM EDTA
0.5% SDS
Hybridization Buffer
750 mM NaCl
1% SDS
50 mM Tris-Cl pH 7.0
1 mM EDTA
15% formamide (store in the dark at 4 °C)
Always add Superase-in fresh before use
2x SSC Wash Buffer
2x NaCl and Sodium citrate (SSC) (diluted from 20x SSC Invitrogen stock)
0.5% SDS
2X RNA fragmentation buffer
18mM MgCl2
450mM KCl
300mM Tris-CL pH 8.3
2x RNA loading Dye:
95% Formamide
0.02% SDS
0.02% bromophenol blue
0.01% Xylene Cyanol
1mM EDTA
3' RNA adapter sequence	5rAppCTGTAGGCACCATCAAT/3ddC
RT primer sequence	AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGTAGATCTCGGTGGTCGC/iSp18/CACTCA/iSp18/TTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTATTGATGGTGCCTACAG