Мелкосерийное Распространение человека ИПСК в бессывороточной условиях для рутинного Иммуноцитохимическая Характеристика
Summary
Regular characterization of induced pluripotent stem cells (iPSCs), to ascertain maintenance of their pluripotent state, is an important step before these cells are used for other applications. Here we describe a method for the small-scale propagation of human iPSCs specifically designed to enable their easy and routine characterization via immunocytochemistry.
Abstract
There is great interest in utilizing human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) for disease modeling and cell therapeutics due to their patient specificity and characteristic stemness. However, the pluripotency of iPSCs, which is essential to their functionality, must be confirmed before these cells can be used in such applications. While a rigorous characterization of iPSCs, through different cellular and functional assays is necessary to establish their pluripotency, routine assessment of pluripotency maintenance can be achieved more simply and effectively through immunocytochemical techniques. Here, we present a systematic protocol for culturing hiPSCs, in a scaled-down manner, to particularly facilitate the verification of their pluripotent state using immunocytochemistry. More specifically, this methodology encompasses an efficient and cost-effective means of growing iPSCs in serum-free conditions and plating them on small chamber slides or glass coverslips ideal for immunocytochemistry.
Introduction
Перепрограммирование взрослого человека соматических клеток в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки (иПСК) обеспечивает способ получить потенциально неограниченный запас клеток конкретного пациента для изучения болезнью 1, 2. Резюмируя фенотипа заболевания в пробирке бы сделать его правдоподобным , чтобы исследовать клеточные и молекулярные механизмы , связанные с болезнью, а также улучшить обнаружение наркотиков и персонализированной медицины 3. Кроме того, человеческие иПСК (hiPSCs) обеспечивают возможность получения специфических типов клеток , которые могут быть использованы в качестве уникального ресурса для замены мертвых или дисфункциональные клеток и восстановления функции в контексте нескольких расстройств 4, 5.
Важной предпосылкой к использованию ИПСК в вышеупомянутых приложений гарантирует, что их плюрипотентные и недифференцированное состояние сохраняется в процессе расширения в культуре. Как правило, Techniqжает , такие как проточной цитометрии, вестерн – блоттинга, полимеразной цепной реакции и функциональных анализов, которые требуют большого количества клеток и специализированного оборудования, используются для детального анализа иПСК плюрипотентности 6, 7, 8, 9, 10. Тем не менее, процедура оценки недифференцированном состоянии по ИПСК "эффективно может быть достигнуто за счет ограниченного распространения этих клеток специально для иммуногистохимии (МУС), тем самым привлекая сокращение времени и ресурсов.
Последние достижения позволяют для роста ИПСК в определенных бессывороточной условиях, что является существенным улучшением по сравнению с традиционными системами культуры, которые требуют мышиные слоев фидерных фибробласты и сывороточных средах. Тем не менее, современная литература не включает в себя четкие протоколы скачкообразные, которые описывают, как переход ИПСК из фидераслой фидерными свободных систем.
В этом контексте настоящее протокол систематически подробно описано, как hiPSCs выращенные на облученный мышиных эмбриональных фибробластов (КПКО), фидерные слои могут быть (1), предназначенный для распространения в бессывороточной среде, и (2), культивировали на мелкосерийном специально для поддержки надежной иммуноцитохимическое анализ. В целом, эта методология представляет собой своевременную и экономически эффективную процедуру для размножения человека ИПСК в бессывороточной условиях для подтверждения их плюрипотентности на регулярной основе с использованием иммуноцитохимии.
Protocol
Representative Results
Discussion
Систематическое протокол, представленный здесь предлагает Timesaving и экономически эффективный метод, в виде уменьшенную техники культуры, специально разработан для поддержки эффективного анализа плюрипотентности с помощью иммуногистохимии.
Основные преимущества опис?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Funding Sources: The University of Arizona, The Jim Himelic Foundation, and the Arizona Center for the Biology of Complex Diseases.
Materials
| DMEM-F12/HEPES | Life Technologies | 11330032 | |
| Knockout Serum Replacement | Life Technologies | 10828028 | |
| L-Glutamine | Life Technologies | 25030081 | |
| MEM-NEAA | Life Technologies | 11140050 | |
| 2-mercaptoethanol | Life Technologies | 21985023 | |
| Recombinant Human FGF-Basic | Cell Sciences | CRF001B | |
| Y-27632 ROCK Inhibitor | R&D | 1254 | |
| Collagenase Type IV | Life Technologies | 17104019 | |
| Matrigel hESC-qualified Matrix | Corning | 354277 | |
| mTeSR1 Basal Medium | StemCell Technologies | 05850 | |
| mTeSR1 5X Supplement | StemCell Technologies | 05850 | |
| Gentle Cell Dissociation Buffer | StemCell Technologies | 07174 | |
| 0.1M PO4 Buffer | In-House | n/a | |
| Paraformaldeyde, prill | Electron Microscopy Sciences | 19202 | |
| 1X Phoshate Buffered Saline | n/a | n/a | |
| Normal Goat Serum | Life Technologies | 16210072 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich | X100 | |
| Oct-4A (C30A3) Rabbit mAb, Sox2 (D6D9) Rabbit mAb, SSEA4 (MC813) Mouse mAb, TRA-1-60(S) (TRA-1-60(S)) Mouse mAb |
Cell Signaling Cell Signaling Cell Signaling Cell Signaling |
2840 3579 4755 4746 |
Alternatively, a combination of 6 pluripotency primary antibodies can be purchased together as a kit in Catalog #9656 |
| Goat anti-Ms IgM Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21042 | |
| Goat anti-Ms IgG3 Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A21151 | |
| Goat anti-Rb IgG Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11037 | |
| Multiwell Cell Culture Plates | Fisher Scientific | 0720080/0720081 | Available in 6, 12, 24, 48, 96 well sizes |
| Chamber Slides | Fisher Scientific | 12 565 21 | Available in Glass or Permanox Plastic in 1, 2, 4, 8, 16 well sizes |
| Coverglass for growth | Fisher Scientific | 12 545 82 | Available in 12, 15, 18, 22 and 25mm sizes |
Riferimenti
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126, 663-676 (2006).
- Park, I. H., et al. Disease-specific induced pluripotent stem cells. Cell. 134, 877-886 (2008).
- Hallett, P. J., et al. Successful function of autologous iPSC-derived dopamine neurons following transplantation in a non-human primate model of Parkinson’s disease. Cell stem cell. 16, 269-274 (2015).
- Haston, K. M., Finkbeiner, S. Clinical Trials in a Dish: The Potential of Pluripotent Stem Cells to Develop Therapies for Neurodegenerative Diseases. Annu rev pharm toxicol. 56, 489-510 (2016).
- Zhang, L., et al. Derivation and high engraftment of patient-specific cardiomyocyte sheet using induced pluripotent stem cells generated from adult cardiac fibroblast. Circ heart fail. 8, 156-166 (2015).
- Byrne, J. A., Nguyen, H. N., Reijo Pera, R. A. Enhanced generation of induced pluripotent stem cells from a subpopulation of human fibroblasts. PloS one. 4, 7118 (2009).
- Sivapatham, R., Zeng, X. Generation and Characterization of Patient-Specific Induced Pluripotent Stem Cell for Disease Modeling. Methods mol bio. 1353, 25-44 (2016).
- Park, I. H., et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, 141-146 (2008).
- Ruff, D., Lieu, P. T. Profiling stem cells using quantitative PCR protein assays. Methods mol bio. 997, 225-236 (2013).
- Pripuzova, N. S., et al. Development of a protein marker panel for characterization of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) using global quantitative proteome analysis. Stem cell res. 14, 323-338 (2015).
- Fusaki, N., Ban, H., Nishiyama, A., Saeki, K., Hasegawa, M. Efficient induction of transgene-free human pluripotent stem cells using a vector based on Sendai virus, an RNA virus that does not integrate into the host genome. Proc jpn acad ser B phys biol sci. 85, 348-362 (2009).
- Bigdeli, N., et al. Adaptation of human embryonic stem cells to feeder-free and matrix-free culture conditions directly on plastic surfaces. J Biotechnol. 133, 146-153 (2008).
- Stover, A. E., Schwartz, P. H. Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging. Methods mol bio. 767, 137-146 (2011).
