סריקת calorimetry דיפרנציאלי המודד את טמפרטורת מעבר התרמית (ים) ו אנרגית חום כוללת הנדרשת כדי לפגל חלבון. תוצאות שהתקבלו משמשות כדי להעריך את יציבות התרמית של אנטיגנים חלבון בניסוחי חיסון.
סריקת calorimetry דיפרנציאלי (DSC) הוא שיטה אנליטית אשר מודדת את קיבולת חום הטוחנת של דגימות כפונקציה של טמפרטורה. במקרה של דגימות חלבון, פרופילי DSC לספק מידע על יציבות תרמית, ובמידה מסוימת הוא מעין "טביעת אצבע" מבנית שיכול לשמש כדי להעריך קונפורמציה מבני. הדבר מתבצע באמצעות קלורימטר סריקת הפרש המודד את טמפרטורת מעבר התרמית (נמסה בטמפרטורה; T מ ') ואת האנרגיה הנדרשת כדי לשבש את יחסי הגומלין לייצוב המבנה השלישוני (אנתלפיה; ΔH) של חלבונים. נעשות השוואות בין הניסוחים כמו גם הרבה ייצור, והבדלי ערכים הנגזרים להצביע על הבדלים יציבים תרמית קונפורמציה מבני. נתונים הממחישים את שימוש DSC בסביבה תעשייתית עבור מחקרי יציבות, כמו גם ניטור צעדי ייצור עיקריים מופיעים הוכחה ליעילות של פרו זהtocol. לשם השוואה לשיטות אחרות להערכת יציבות התרמית של תצורות חלבון, DSC היא חסכונית, דורשת כמה צעדי הכנת מדגם, וגם מספקת פרופיל התרמודינמית מלא של תהליך התגלגלות החלבון.
סריקה calorimetry דיפרנציאלי (DSC) היא שיטה ניסיונית אשר מודד את ההבדל ישירות ספיגת אנרגיית חום המתרחשים קרוב משפחה מדגם עזר במהלך שינוי הטמפרטורה מוסדר 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 10,, 11, 12. שבוצעה במשך קלורימטר סריקת הפרש, השיטה כרוכה החדרת אנרגית חום לתוך תא מדגם תא התייחסות בו זמנית תוך הגדלת הטמפרטורה זהה של התאים הם לאורך זמן 2, 13,14. בשל הבדל בהרכב המדגם ואת ההתייחסות, כמות האנרגיה שונה תידרש כדי להעלות את הטמפרטורה של התאים 2, 12, 13. לפיכך, כמות העולה על האנרגיה הנדרשת כדי לפצות על הבדלי הטמפרטורה בין התאים נמדד בקורלציה ישירות תכונות תרמודינמיות ספציפיים של המדגם 1, 3.
ב -1960, MJ אוניל וא ווטסון של פרקין אלמר פתחו את קלורימטר סריקת ההפרש הראשון למדוד את זרימת החום של חומרים מוצקים 2, 3, 4. במקביל, PL Privalov ו- DR Monaseldze EL של המכון לפיזיקה, הרפובליקה של גאורגיה (ברית המועצות לשעבר) יצר קלורימטר adiabatic ההפרש ייחודי שיכול לשמש FOr ביוכימיים מחקר 5, 6. בהמשך לכך, צוות של Andronikashvili במכון לפיסיקה, הרפובליקה של גאורגיה, דיווח קיבולת החום של ביומולקולות כגון חלבונים סיביים כדוריים, DNA, RNA באמצעות DSC 7, 8, 9. מספר צוותים בראשות Sturtevant 10, 11, 12, ברנדט 13, ו Privalov 14, 15, 16 מתמקדת בפיתוח של תיאוריה ויישומים מעשיים של DSC לחקור את הפרטים התרמודינמית של התגלגלות חלבון. שווי DSC בלימוד מבנים מולקולריים גדולים כמו פאגים, הכלורופלסט, גבישים נוזליים פוספוליפידים, וחלבוני בשר גם דווח 17 </ sup>, 18, 19, 20.
DSC הפכה כעת שבשגרה במחקר של תרופות ופיתוח עבור הערכת יציבות תרמית של ביומולקולות, במיוחד חלבונים 1, 21, 22. זהו בעיקר בשל התקדמות מבחינת רגישות ואוטומציה של המכשור המשמש לביצוע הניסוי 23, 24. כאן, התוצאה הסופית של הניסוי DSC, כלומר, קיבול חום טוחנת כפונקציה של הטמפרטורה, משמש כדי להעריך את הפרמטרים הבאים התרמודינמית (שינוי קיבול חום (ΔCp), אנתלפיה (ΔH), האנטרופיה (ΔS) אנרגיה חופשית, ו גיבס (ΔG)) באמצעות המשוואה הבאה:
eq1.jpg "/> (1)
(2)
(3)
(4)
(5)
איפה Cp נמדד קיבול חום; q הוא זרימת החום לתוך החומר למבחן; T 0 ו- T הם הטמפרטורות התחלתי וסופי של המעבר בהתאמה 22, 25. כמו כן ראוי לציין כי המשוואות לעיל חלות לחלבונים חד תחום שיכול לעבור מעבר של שתי מדינות והפיכות תרמית התגלגלות 22. ניתוח של חלבונים מורכבים יותר (למשל, חלבונים שאינם שתי מדינות לשני עמים, ו oligomers) hותעיף דווח על ידי ואח 'פריירה. 26; ג'ונסון et al. 27; ו Kasimova et al. 28.
על מנת לקבוע האם חלבון עובר המעבר של שתי מדינות או צורות ביניים במהלך denaturation תרמית, אנתלפיה נגזר באופן ניסיוני (ΔH; התייחס גם קאל ΔH אנתלפיה קלוריות כמו) מושווה אנתלפיה נגזר באמצעות המשוואה van't הוף כדלקמן (גם המכונה אנתלפיה van't הוף; ΔH VH):
(6)
איפה T מ 'היא הטמפרטורה האמצע של המעבר, R הוא קבוע הגזים האידיאלי (1.987 cal mol -1 K -1) ו- Y הוא חלק קטן מהאוכלוסייה חלבון במדינת פרש 16, 29. אםΔH VH שווה ΔH קאל; או ΔH VH / ΔH קאל שווה ל -1, אז החלבון עובר מעבר "הכל או לא כלום" (כלומר מעבר של שתי מדינות) 16, 25, 29. עם זאת, אם ΔH VH הוא פחות מ ΔH קאל; או ΔH VH / ΔH קאל הוא פחות מ 1, החלבון עובר מעבר הלא שתי מדינות לשני עמים 16, 25, 29. יחס ΔH VH / ΔH קאל גם תואם את חלקם של מבנה החלבון שנמס כיחידה שיתופית התרמודינמית או התחום 26.
הפרמטרים התרמודינמית הנ"ל כגון ΔG ו ΔH לספק מידע שימושי על יציבות התרמית של חלבונים, כולל תרופות ביולוגיות 30. עם זאת, הדגש יהיה מונח על T מ 'ΔH בפרסום זה, כפי שהם על הערכים המדווחים עבור פרוטוקול זה. מ T היא טמפרטורת נקודת האמצע של המעבר, שבו המקופל והמדינות הפרשיות של החלבון הן בשיווי המשקל (כלומר, ΔG = 0) 25, 31. ככל T מ 'של חלבון, גבוה יותר יציבות תרמית שלה 31. ΔH תואמת את השטח מתחת לשיא (ים) של קיבול חום לעומת גרף טמפרטורה (הידוע גם בשם thermogram) שנוצר בסוף הניסוי DSC 16, 25. זוהי האנרגיה הנדרשת כדי לפגל חלבונים והוא יכול לשמש כדי להעריך את החלק היחסי פעיל (א F) בניסוח חלבון (כלומר, חלקם של חלבונים עם קונפורמציה פעיל מדגם) באמצעות המשוואה הבאה:
jove_content ">איפה ΔH הוא אנתלפיה נגזר באופן ניסיוני של מדגם החלבון ו- Q הוא אנתלפיה שנקבע הפניה היטב מאופיינת או חלבון סטנדרטי 22. האמידה של F היא משמעותית לניטור היציבות בזמן האמת של מוצרים, כמו גם ביצוע מחקרי יציבות בתנאי קיצון כנדרשת בהנחיות ICH 32. גם השוואה של ΔH מספק מידע על הקומפקטיות של קונפורמציה מבנה שלישוני של חלבון 31.
פרוטוקול זה מפרט נוהל להערכת יציבות התרמית של חלבונים בסביבה תעשייתית כבר נעשה שימוש נרחב לגיבוש חיסונים. הוא פותח באמצעות קלורימטר סריקת הפרש אוטומטי שיוצר f תוצאות לשחזוראו ריכוזי חלבון נמוך כמו 300 מיקרוגרם / מ"ל.
הליך זה כבר שולב בהצלחת חבילות בדיקת אפיון שונות, כוללים מחקרי יציבות השוואת מוצר 21. במחקרי יציבות בזמן אמת, DSC משמש כדי לפקח T מ, כמו גם להעריך את F א הביולוגי לאורך זמן כדי לקבוע את חיי המדף שלהם. באשר השוואת מוצר, הוא משמש כדי להעריך את ההשפעה של תהליך ושינוי מתקן וכן השפעת צעדי ייצור מפתח על קונפורמציה המבני של המון מיוצר. זה בדרך כלל כולל ההשוואה הישירה של ΔH של הרבה מיוצר למוצר הפנית כאזור המוצר האידיאלי. בנוסף, DSC הוכיחה להיות כלי אנליטי שימושי ללימודי ניסוח מוצר 37. ה- T מ 'של חלבון מאגרים שונים בריכוזים שונים שניתן להשתמש בהם כדי לקבוע את הניסוח כי ומציע את היציבות ביותרהחלבון.
כדי להבטיח את האמינות של השיטה הזאת ואת האובייקטיביות של תוצאותיה, חשוב לשמור פרמטרי בדיקה עקביים מהריצה לרוץ בתוך אותו המחקר (למשל, מחקר ניסוח חיסון). עם זאת, ההליך יכול להיות שונה כדי להכיל הבדלים בתכונות הפיזיות של חלבונים שונים. דוגמא שינוי שניתן לעשות היא לשנות את קצב הסריקה של הניסוי 38, 39. חלבונים כי היו מועדים אגרגטים להרכיב כאשר מחומם נבחנו בקצב סריקה מהיר יותר (למשל, 120 ° C / שעה), כדי למנוע את התרומה של אגרגטים לפרופיל המעבר התרמי, כמו גם סתימה בנימי קלורימטר. ראוי לציין כי סריקת קצב יכול להשפיע על תוצאות ניסוי DSC 38. התרחבותה של שיא מעבר התרמית נצפתה עם הגדלת שיעורי סריקה בחלק פרוחלבונים; עם זאת, T מ 'נשאר קבוע למדי 38. יתר על כן, צעדי דיאליזת degassing להכנת מדגם הם גם מאוד קריטיים עבור תוצאות מדויקות 31. דיאליזה מבטיחה כי ההבדל היחיד בהרכב המדגם למאגר הוא החלבון; וכך, כל עודף החום נספג על ידי המדגם ניתן לייחס קיבולת החום של החלבון. Degassing מבטיחה ניתוח נפח מדויק, כמו אקסטרפולציה של פרמטר תרמודינמי מניחה שאירוע ההתגלגלות מתרחש תחת נפח קבוע ולחץ 31. החלק לחץ מתמיד של ההנחה היא מוסברת על ידי שמירת לחץ החנקן של מערכת כאמור בסעיף 1.1 של ההליך.
בהשוואה לשיטות אחרות של בקביעת יציבותה של תצורות חלבון כגון מעגלי dichroism (CD) פלואורסצנטי Spectroscopies, DSC מציעה מספר יתרונות בתוך comהגדרה מסחרית לרבות חיסכון בעלויות ובזמן. ראשית, העיצוב adiabatic של קלורימטר סריקה ההפרש מאפשרת מדידה של יציבות תרמית עם דיוק טמפרטורה טובה יותר לעומת מדידות עם מכשור עבור דיסקים CD ו הקרינה Spectroscopies 6. שנית, בניגוד CD, את הדיוק של נתוני DSC אינו תלוי helicity של החלבון 39, 40; עם זאת, CD מספק מידע נוסף על ההתגלגלות של המבנה מהשני, אשר יהיה חינם אל DSC 41. בנוסף, שמירת לחץ קבוע של מערכת DSC מאפשר לבדיקה עם טווח רחב של טמפרטורות ללא רותחים המדגם; וכך, מגוון רחב של חלבונים ניתן לבדוק על ידי DSC.
בעוד DSC היא גישה מהירה יחסית וישירה כדי לקבוע את יציבות התרמית של תרופות ביולוגיות, זה לא בלי מגבלות. ראשית, הבסיסקו צעד חיסור מציג צורה כלשהי של חוסר עקביות אנושית לתוך ניתוח נתונים הגולמי; וכך, וריאציות בתוצאות ניתן להבחין בין משתמשים שונים. שנית, calorimeters סריקת ההפרש יש מגבלות ריכוז מינימאליות אשר עלול להיות קשה להשיג בקנה מידת ייצור בתפזורת. שלישית, ΔH של denaturation תרמית ההפיכה אינו מוחלט; מה שמרמז על כך נגזר ΔG (אינדיקטור של יציבות חלבון) בתרחישים דומים יכול להיות מטעה. יתר על כן, השיטה מתאימה ביותר דגימות מטוהרות. נוכחות של זיהומים עשויה גם לגרום שינוי T מ אם קיימת אינטראקציה עם החלבון תחת חקירה, או המראה של מעברי תרמית חדשים אם אין אינטראקציה. במקרה כל תכונות נוספות אלה על thermograms ניתן לייחס בטעות דגימות, ובכך להשפיע על הפרשנות של התוצאות. למרות מגבלות אלה, DSC נשאר שיטה אמינה שיכולה לספק מידע מפורט על התרמודינמית החלבון ה התגלגלות תהליך אם מיושם כהלכה 42.
לסיכום, DSC מציע יתרון משמעותי ככלי הודעה קונפורמציה למוצרי חיסון הביניים שלהם. שני הפרמטרים, T מ 'ΔH, שנאספו עבור מערך של הרבה של אותו מוצר יכול להיות הבסיס האמפירי, שניתן להשתמש בהם כדי לבחון את ההשפעה של שינויים בתהליך, ניסוח, ותנאי אחסון על מבנה שלישוני ויציבות של חלבון אנטיגנים נגיפיים 21, 43.
The authors have nothing to disclose.
הכותבים הם מאוד אסיר תודה ליוסף מנצ'יני (לשעבר עם GE Healthcare), פאבל Czudec, תומאס קייג (מוגבל Malvern מכשירים) עבור תפקידם ההתקנה וההדרכה על קלורימטר סריקת הפרש, Sasmit Deshmukh וובסטר Magcalas לדיונים שלהם.
Differential Scanning Calorimeter | Malvern Instruments Ltd | 28428948 (Via GE Healthcare) | Has an autosampler for automated dispensing of samples into the cell to reduce human effort and errors. |
Contrad 100 | Decon Laboratories Inc | 1504 | Dilute with water to 20% before use |
500µL Polypropylene round bottom 96 well plate | Canadian Life Science | ML072100 | Equivalent plates from other suppliers (e.g., VW) can also be used |
MicroCal ThermoVac | Malvern Instruments Ltd | N/Ap | provided with the Cap VP DSC |
Biosafety cabinet | Labconco | Logic+ – A2 | biocontainment laminar flow cabinet for sample preparation |
Slide-A-Lyzer dialysis cassette | Thermo Scientific | 66810 or 66380 | to equilibrate the sample and buffer |