Differential-Scanning-Kalorimetrie misst die thermische Übergangstemperatur (en) und die gesamte Wärmeenergie benötigt, um ein Protein zu denaturieren. Die erhaltenen Ergebnisse werden verwendet, um die thermische Stabilität von Proteinantigenen in Vakzin-Formulierungen zu beurteilen.
Differential-Scanning-Kalorimetrie (DSC) ist eine analytische Technik, die die molare Wärmekapazität der Proben als Funktion der Temperatur mißt. Im Falle von Proteinproben, DSC-Profile liefern Informationen über die thermische Stabilität, und in gewissem Maße dient als strukturelle "Fingerabdruck", der verwendet werden kann strukturelle Konformation zu beurteilen. Es wird unter Verwendung eines Differential – Scanning – Kalorimeter durchgeführt, die die Wärmeübergangstemperatur misst (Schmelztemperatur, T m) und die Energie erforderlich , um die Wechselwirkungen zu stören die Tertiärstruktur stabilisierenden (Enthalpie; & Delta; H) von Proteinen. Vergleiche werden zwischen Formulierungen sowie Fertigungslose, und die Unterschiede in abgeleiteten Werte zeigen Unterschiede in der thermischen Stabilität und strukturelle Konformation hergestellt. Die Daten, welche die Verwendung von DSC in einem industriellen Umfeld für Stabilitätsstudien sowie die Überwachung wichtiger Fertigungsschritte werden als Beweis für die Wirksamkeit dieses Pro bereitgestelltkoll. Im Vergleich zu anderen Verfahren zur Bestimmung der thermischen Stabilität von Protein-Konformationen der Beurteilung ist DSC kostengünstig, erfordert nur wenige Probenvorbereitungsschritte und stellt auch eine vollständige thermodynamischen Profil des Proteins Entfaltungsprozess.
Differential – Scanning – Kalorimetrie (DSC) ist ein experimentelles Verfahren , das direkt die Differenz der Wärmeenergieaufnahme misst in einer Probe relativ zu einer Referenz bei einer geregelten Temperaturänderung unter 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 , 10, 11, 12. Durchgeführt in einem Differential – Scanning – Kalorimeter, umfasst das Verfahren die Einführung von Wärmeenergie in eine Probenzelle und eine Referenzzelle während gleichzeitig gleich der Temperatur der beiden Zellen im Laufe der Zeit zunehmende 2, 13,14. Aufgrund des Unterschieds in der Zusammensetzung der Probe und der Referenz, werden unterschiedliche Energiemenge erforderlich 2 , die Temperatur der Zellen zu erhöhen, 12, 13. So kann die Temperaturdifferenz die überschüssige Menge an Energie zwischen den Zellen zu kompensieren , benötigt wird gemessen und direkt in Beziehung zu spezifischen thermodynamischen Eigenschaften der Probe 1, 3.
In den 1960er Jahren entwickelte MJ O'Neil und E. Watson von Perkin Elmer die erste Differential – Scanning – Kalorimeter den Wärmefluss von Feststoffen 2, 3, 4 zu messen. Parallel dazu PL Privalov und DR Monaseldze EL des Instituts für Physik, Republik Georgien (ehemalige UdSSR) schuf eine einzigartige Differential adiabatische Kalorimeter, die verwendet werden können, for biochemische Forschung 5, 6. Anschließend Andronikashvili Team am Institut für Physik, Republik Georgien, berichtete die Wärmekapazität von Biomolekülen wie faserig und globuläre Proteine, DNA und RNA unter Verwendung von DSC 7, 8, 9. Mehrere Teams unter Leitung von 10 Sturtevant, 11, 12, Brandts 13 und 14 Privalov, 15, 16 auf die Entwicklung der Theorie konzentriert und praktische Anwendungen der DSC die thermodynamischen Details der Proteinentfaltung zu untersuchen. Der Wert der DSC in das Studium großen supramolekularen Strukturen wie Phagen, Chloroplasten, Phospholipid Flüssigkristalle und Fleischproteine wurden auch 17 berichtet </ sup>, 18, 19, 20.
DSC wurde nun alltäglich in der pharmazeutischen Forschung und Entwicklung für die Beurteilung der thermischen Stabilität von Biomolekülen werden, insbesondere Proteine , 1, 21, 22. Dies ist vor allem aufgrund der Fortschritte in Bezug auf die Empfindlichkeit und die Automatisierung der Instrumentierung das Experiment 23, 24 zur Durchführung verwendet. Hier wird das endgültige Ergebnis der DSC-Experiment, nämlich molare Wärmekapazität als Funktion der Temperatur, verwendet wird, die folgenden thermodynamischen Parameter (Änderung der Wärmekapazität (& Delta; Cp) zu schätzen, Enthalpie (& Dgr; H), Entropie (& Delta; S) und Gibbs-Energie (& Delta; G)) unter Verwendung der folgenden Gleichung:
eq1.jpg "/> (1)
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Wo Cp Wärmekapazität gemessen; q ist der Wärmestrom in das Testmaterial; T 0 und T sind die Anfangs- und Endtemperaturen des Übergangs bzw. 22, 25. Es ist auch erwähnenswert , dass die Gleichungen , die oben auf Einzeldomänen – Proteine anzuwenden , die thermische Zweizustandsübergang und reversiblen Entfaltung 22 durchlaufen kann. Analyse komplexer Proteine (zB nicht-Zwei-Zustands – Proteine und Oligomeren) have durch Friere et al. 26; Johnson et al. 27; und Kasimova et al. 28.
Um zu bestimmen , ob ein Protein erfährt Zweizustandsübergang oder bildet einen Zwischenprodukte bei der thermischen Denaturierung, die experimentell abgeleiteten Enthalpie (& Dgr; H, auch als kalorimetrische Enthalpie & Dgr; H bezeichnet Cal) an die Enthalpie gegen unten die van't Hoff – Gleichung abgeleitet wird (auch bezeichnet als van't Hoff Enthalpie; & Delta; H VH):
(6)
Wobei T m die midpoint temperature des Übergangs ist, R die ideale Gaskonstante (1,987 cal mol -1 K -1) ist und Y der Anteil der Proteinpopulation im ausgeklappten Zustand 16, 29. Ob& Dgr; H VH gleich & Delta; H Cal; oder & Delta; H VH / AH Cal ist gleich 1 ist , dann erfährt das Protein eine "Alles-oder-Nichts" Übergang (dh Zweizustandsübergang) 16, 25, 29. Wenn jedoch & Delta; H VH kleiner als & Dgr; H Cal; oder & Dgr; H VH / & Dgr; H Cal kleiner als 1 ist , unterliegt das Protein ein nicht-Zweizustandsübergang 16, 25, 29. Das Verhältnis von & Delta; H VH / & Dgr; H Cal entspricht auch der Anteil der Proteinstruktur , die 26 als thermodynamischen kooperativer Einheit oder Domäne schmilzt.
Die thermodynamischen Parameter, die oben wie & Dgr; G und & Delta; H erwähnt liefern nützliche Informationen über die thermische Stabilität von Proteinen, einschließlich Biologika 30. Allerdings wird der Schwerpunkt auf T m und & Delta; H in dieser Publikation verlegt werden, da sie die angegebenen Werte für dieses Protokoll sind. T m ist die mittlere Temperatur des Übergangs, in dem die gefalteten und der ungefalteten Zustände des Proteins sind im Gleichgewicht ( das heißt & Dgr; G = 0) 25, 31. Je höher die T m eines Proteins, desto höher ist seine thermische Stabilität 31. & Dgr; H entspricht der Fläche unter der Spitze (n) der Wärmekapazität gegenüber Temperaturdiagramm (auch als Thermogramms bekannt) erzeugt am Ende des DSC – Experiment 16, 25. Es ist die Energie , die erforderlich Proteine zu denaturieren und die verwendet werden können , die aktive Fraktion (F a) in einer Proteinformulierung (dh der Anteil der Proteine mit aktiver Konformation in einer Probe) mittels der folgenden Gleichung zu ermitteln:
jove_content ">Wo & Delta; H ist die experimentell ermittelten Enthalpie der Proteinprobe und Q ist die Enthalpie für eine gut charakterisierte Referenz oder standardisierte Protein bestimmt 22. Die Schätzung der F a ist von Bedeutung für die Echtzeit – Stabilität von Produkten Überwachung sowie Durchführung von Stabilitätsstudien unter Stressbedingungen erforderlich , wie ICH – Richtlinien 32. Vergleich von & Delta; H stellt auch Informationen über die Kompaktheit der Tertiärstruktur – Konformation eines Proteins 31.
Dieses Protokoll Details eines Verfahrens für die thermische Stabilität von Proteinen in einer industriellen Umgebung zu bewerten und wurde für die Formulierung von Impfstoffen, umfassend verwendet. Es wurde unter Verwendung eines automatisierten Differentialscanningkalorimeter entwickelt, die reproduzierbare Ergebnisse f erzeugtoder Protein-Konzentrationen so niedrig wie 300 & mgr; g / mL.
Dieses Verfahren wurde in verschiedenen Charakterisierung Testpakete, einschließlich Stabilität und Produkt Vergleichbarkeitsstudien 21 erfolgreich integriert. In Echtzeit Stabilitätsstudien, wird DSC verwendet , um die T m zu überwachen, sowie die F a von Biologics im Laufe der Zeit schätzen , um ihre Haltbarkeit zu bestimmen. Im Hinblick auf die Produkt Vergleichbarkeit wird es verwendet, um die Auswirkungen von Prozess- und Facility Änderung sowie die Wirkung der wichtigsten Herstellungsschritte auf die strukturelle Anpassung der erzeugten Partien beurteilen. Dies umfasst in der Regel den direkten Vergleich der & Delta; H der produzierten Menge auf ein Referenzprodukt, das als ideale Produkt bezeichnet wurde. Darüber hinaus hat DSC ein nützliches analytisches Werkzeug für die Produktformulierungsstudien 37 erwiesen. Die T m eines Proteins in verschiedenen Puffern und verschiedenen Konzentrationen können verwendet werden , um die Formulierung zu bestimmen, die am meisten Stabilität vorbringt , umdas Protein.
Um die Zuverlässigkeit dieser Methode und Objektivität ihrer Ergebnisse zu gewährleisten, ist es wichtig , Testparameter konsistent von Lauf zu halten innerhalb der gleichen Studie (zB Impfstoffformulierung Studie) zu laufen. Jedoch kann das Verfahren der physikalischen Eigenschaften verschiedener Proteine, um Unterschiede modifiziert werden. Ein Beispiel für eine Modifikation , die vorgenommen werden kann , ist die Änderung der Abtastgeschwindigkeit des Experiments 38, 39. Proteine , die zur Bildung von Aggregaten neigen waren beim Erhitzen mit einer schnelleren Abtastrate sucht wurden (beispielsweise 120 ° C / h) , um den Beitrag von Aggregaten der thermischen Übergangsprofil zu vermeiden sowie die Kapillaren des Kalorimeters verstopfen. Es ist erwähnenswert, dass Rate Scannen 38 das Ergebnis eines DSC – Experiment beeinflussen können. Eine Verbreiterung des thermischen Übergangs Spitze wurde mit zunehmender Abtastraten in einem gewissen pro beobachtetteine; jedoch blieb T m ziemlich konstant 38. Darüber hinaus sind die Dialyse und Entgasung Schritte zur Probenvorbereitung ist auch sehr wichtig für genaue Ergebnisse 31. Dialyse stellt sicher, dass der einzige Unterschied in der Zusammensetzung der Probe und der Puffer ist das Protein; Somit sind alle überschüssige Wärme von der Probe absorbierte kann der Wärmekapazität des Proteins zugeschrieben werden. Entgasen sorgt für eine präzise Volumenanalyse, da die Extrapolation der thermodynamischen Parameter annimmt , dass die Entfaltungsereignis auftritt unter konstantem Volumen und der Druck 31. Der konstante Druckanteil der Annahme wird durch Stickstoffunterdrucksetzen des Systems gemäss Abschnitt 1.1 des Verfahrens berücksichtigt.
Im Vergleich zu anderen Methoden der Stabilität von Protein-Konformationen wie Zirkulardichroismus (CD) und Fluoreszenz-Spektroskopie zu bestimmen, DSC bietet eine Reihe von Vorteilen in einem comHandelseinstellung einschließlich Kosten- und Zeiteinsparungen. Erstens erlaubt die adiabatische Design eines Differentialscanningkalorimeters zur Messung der thermischen Stabilität mit einer besseren Temperaturgenauigkeit im Vergleich zu Messungen mit Instrumenten für die CD und Fluoreszenzspektroskopie 6. Zweitens, im Gegensatz zu CD, ist die Genauigkeit der DSC – Daten nicht abhängig von der Helizität des Proteins 39, 40; jedoch bietet CD zusätzliche Informationen über die Entfaltung der Sekundärstruktur, die dem DSC 41 kostenlos sein würde. Zusätzlich erlaubt die Druckbeaufschlagung des DSC- System zum Testen mit einem breiten Temperaturbereich, ohne die Probe siedet; Somit kann ein breites Spektrum von Proteinen, die durch DSC getestet werden.
Während DSC eine relativ schnelle und einfache Methode ist die thermische Stabilität von Biologika, um zu bestimmen, ist es nicht ohne Einschränkungen. Zuerst wird die BasisLinie Subtraktion Schritt stellt eine Form der menschlichen Widersprüchlichkeit in den Rohdaten Analyse; Somit Schwankungen Ergebnisse können zwischen verschiedenen Benutzern beobachtet werden. Zweitens haben Differential-Scanning-Kalorimeter minimale Konzentrationsgrenzen, die schwierig sein könnte, bei Massenproduktionsmaßstab zu erreichen. Drittens ist die AH der irreversiblen thermischen Denaturierung nicht absolut; was bedeutet, dass abgeleitete & Delta; G (ein Indikator für die Proteinstabilität) in ähnlichen Szenarien können irreführend sein. Darüber hinaus arbeitet das Verfahren am besten für gereinigten Proben. Anwesenheit von Verunreinigungen kann entweder bewirken eine Verschiebung der T m , wenn es eine Wechselwirkung mit dem Protein untersucht wird, oder das Aussehen des neuen thermischen Übergänge , wenn keine Wechselwirkung auftritt. In jedem Fall sind die zusätzlichen Funktionen auf den Thermogrammen können zu Unrecht zu den Proben zugeschrieben werden, wodurch die Interpretation der Ergebnisse zu beeinträchtigen. Trotz dieser Einschränkungen bleibt, DSC, ein zuverlässiges Verfahren, die detaillierte Informationen über die thermodynamischen th liefern kannwenn sie umgesetzt e Protein Prozess ordnungsgemäß 42 Entfaltung.
Abschließend bietet DSC erheblichen Vorteil als Konformationsänderung Auslese Werkzeug für die Impfstoff-Produkte und deren Vorprodukte. Die beiden Parameter, T m und & Dgr; H kann eine empirische Basislinie werden für eine Reihe von Chargen des gleichen Produkts gesammelt , die verwendet werden können , um die Auswirkungen von Prozessänderungen, Formulierung und Lagerbedingungen auf die Tertiärstruktur und die Stabilität des Proteins zu untersuchen und virale Antigene 21, 43.
The authors have nothing to disclose.
Die Autoren sind sehr dankbar, dass Joseph Mancini (früher mit GE Healthcare), Pawel Czudec, Thomas Cage (Malvern Instruments Limited) für ihre Rolle bei der Installation und Schulung auf dem Differential-Scanning-Kalorimeter, Sasmit Deshmukh und Webster Magcalas für ihre Gespräche.
Differential Scanning Calorimeter | Malvern Instruments Ltd | 28428948 (Via GE Healthcare) | Has an autosampler for automated dispensing of samples into the cell to reduce human effort and errors. |
Contrad 100 | Decon Laboratories Inc | 1504 | Dilute with water to 20% before use |
500µL Polypropylene round bottom 96 well plate | Canadian Life Science | ML072100 | Equivalent plates from other suppliers (e.g., VW) can also be used |
MicroCal ThermoVac | Malvern Instruments Ltd | N/Ap | provided with the Cap VP DSC |
Biosafety cabinet | Labconco | Logic+ – A2 | biocontainment laminar flow cabinet for sample preparation |
Slide-A-Lyzer dialysis cassette | Thermo Scientific | 66810 or 66380 | to equilibrate the sample and buffer |