Målinriktad<em> In situ</em> mutagenes av Histon Gener i knoppande jäst
Summary
A strategy for generating mutations in histone genes at their endogenous location in Saccharomyces cerevisiae is presented.
Abstract
We describe a PCR- and homologous recombination-based system for generating targeted mutations in histone genes in budding yeast cells. The resulting mutant alleles reside at their endogenous genomic sites and no exogenous DNA sequences are left in the genome following the procedure. Since in haploid yeast cells each of the four core histone proteins is encoded by two non-allelic genes with highly homologous open reading frames (ORFs), targeting mutagenesis specifically to one of two genes encoding a particular histone protein can be problematic. The strategy we describe here bypasses this problem by utilizing sequences outside, rather than within, the ORF of the target genes for the homologous recombination step. Another feature of this system is that the regions of DNA driving the homologous recombination steps can be made to be very extensive, thus increasing the likelihood of successful integration events. These features make this strategy particularly well-suited for histone gene mutagenesis, but can also be adapted for mutagenesis of other genes in the yeast genome.
Introduction
De fyra kärn histonproteiner H2A, H2B, H3 och H4 spela en central roll i den kompaktering, organisation och funktion av eukaryota kromosomer. Två uppsättningar av vardera av dessa histoner bilda histon oktamer, en molekyl spole som styr omslags av ~ 147 baspar av DNA runt sig själv, vilket slutligen resulterar i bildandet av en nukleosom 1. Nukleosomer är aktiva deltagare i en mängd olika kromosombaserade processer, såsom reglering av gentranskription och bildandet av eukromatin och heterokromatin över kromosomer, och som sådan har varit föremål för en intensiv forskning under loppet av de senaste årtiondena. Ett antal mekanismer har beskrivits av vilka nukleosomer kan manipuleras på ett sätt som kan underlätta utförandet av specifika processer – dessa mekanismer innefattar posttranslationell modifiering av histon rester, ATP-beroende nukleosomen ombyggnad, och ATP-oberoende nukleosomen omorganisationoch montering / demontering 2, 3.
Den spirande jästen Saccharomyces cerevisiae är en särskilt kraftfull modellorganism för förståelsen av histon funktion i eukaryoter. Detta kan till stor del tillskrivas den höga graden av evolutionär konservering av histonproteiner hela domänen eukarya och mottaglighet av jäst till en mängd genetiska och biokemiska försöks närmar 4. Omvänd-genetiska metoder i jäst har använts i stor utsträckning för att studera effekterna av specifika histon mutationer på olika aspekter av kromatin biologi. För dessa typer av experiment är det ofta föredraget att använda celler i vilka de mutanta histonerna uttrycks från deras nativa genomiska loci, såsom expression från autonoma plasmider kan leda till onormala intracellulära nivåerna av histonproteiner (på grund av varierande antal plasmider i celler) och samtidig förändring av kromatin enjöer, vilket i slutändan kan förbrylla tolkningen av resultaten.
Här beskriver vi en PCR-baserad teknik som möjliggör för riktad mutagenes av histon gener vid deras nativa genomiska lägen som inte kräver en kloningssteg och resulterar i alstringen av den önskade mutationen (erna) utan överblivna exogena DNA-sekvenser i genomet. Denna teknik drar fördel av en effektiv homolog rekombination systemet i jäst och har flera gemensamma drag med andra liknande tekniker som utvecklats av andra grupper – notably Delitto Perfetto, platsspecifik genomisk (SSG) mutagenes och kloning fria PCR-baserad allel ersättningsmetoder 5, 6, 7. Men tekniken beskriver vi har en aspekt som gör det särskilt väl lämpad för mutagenes av histon gener. I haploida jästceller, är vart och ett av de fyra kärn histoner som kodas av två icke-allelic och mycket homologa gener: till exempel, är histon H3 kodas av HHT1 och HHT2 gener och de öppna läsramarna (ORF) av de två generna är över 90% identisk i sekvens. Denna höga grad av homologi kan komplicera experiment utformade för att specifikt rikta en av de två histon-kodande gener för mutagenes. Medan de tidigare nämnda metoder kräver ofta användning av åtminstone några sekvenser inom ORF av målgenen för att driva homolog rekombination, den teknik som vi beskriver här använder sig av sekvenser som flankerar de ORF hos histon gener (som delar mycket mindre sekvenshomologi) för rekombinationen steget, vilket ökar sannolikheten för en framgångsrik målinriktning av mutagenes för att den önskade lokuset. Dessutom kan de homologa regionerna som driver rekombination vara mycket omfattande, vilket ytterligare bidrar till en effektiv målinriktad homolog rekombination.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den höga graden av sekvenshomologi mellan de två icke-alleliska gener som kodar för var och en av de fyra kärn histonproteiner i haploida S. cerevisiae-celler kan representera en utmaning för forskare som vill särskilt rikta ett av de två generna för mutagenes. Tidigare beskrivna jästmutagenesmetoder, inklusive Delitto Perfetto, platsspecifik genomisk (SSG) mutagenes och kloning fritt PCR-baserade allel ersättningsmetoder 5, 6,</…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Reine Protacio for helpful comments during the preparation of this manuscript. We express our gratitude to the National Science Foundation (grants nos. 1243680 and 1613754) and the Hendrix College Odyssey Program for funding support.
Materials
| 1 kb DNA Ladder (DNA standards) | New England BioLabs | N3232L | |
| Agarose | Sigma | A5093-100G | |
| Boric Acid | Sigma | B0394-500G | |
| dNTP mix (10 mM each) | ThermoFisher Scientific | R0192 | |
| EDTA solution (0.5M, pH 8.0) | AmericanBio | AB00502-01000 | |
| Ethanol (200 Proof) | Fisher Scientific | 16-100-824 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA) | Sigma | E4884-500G | |
| Lithium acetate dihydrate | Sigma | L6883-250G | |
| MyCycler Thermal Cycler | BioRad | 170-9703 | |
| Poly(ethylene glycol) (PEG) | Sigma | P3640-1KG | |
| PrimeSTAR HS DNA Polymerase (high fidelity DNA polymerase) and 5X buffer | Fisher Scientific | 50-443-960 | |
| Salmon sperm DNA solution | ThermoFisher Scientific | 15632-011 | |
| Sigma 7-9 (Tris base, powder form) | Sigma | T1378-1KG | |
| Sodium acetate trihydrate | Sigma | 236500-500G | |
| Supra Sieve GPG Agarose (low metling temperature agarose) | AmericanBio | AB00985-00100 | |
| Taq Polymerase and 10X Buffer | New England BioLabs | M0273X | |
| Toothpicks | Fisher Scientific | S67859 | |
| Tris-HCl (1M, pH 8.0) | AmericanBio | AB14043-01000 | |
| a-D(+)-Glucose | Fisher Scientific | AC170080025 | for yeast media |
| Agar | Fisher Scientific | DF0140-01-0 | for yeast media |
| Peptone | Fisher Scientific | DF0118-07-2 | for YPD medium |
| Yeast Extract | Fisher Scientific | DF0127-17-9 | for YPD medium |
| 4-aminobenzoic acid | Sigma | A9878-100G | for complete minimal dropout medium |
| Adenine | Sigma | A8626-100G | for complete minimal dropout medium |
| Glycine hydrochloride | Sigma | G2879-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Alanine | Sigma | A7627-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Arginine monohydrochloride | Sigma | A5131-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Asparagine monohydrate | Sigma | A8381-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Aspartic acid sodium salt monohydrate | Sigma | A6683-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Cysteine hydrochloride monohydrate | Sigma | C7880-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Glutamic acid hydrochloride | Sigma | G2128-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Glutamine | Sigma | G3126-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Histidine monohydrochloride monohydrate | Sigma | H8125-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Isoleucine | Sigma | I2752-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Leucine | Sigma | L8000-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Lysine monohydrochloride | Sigma | L5626-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Methionine | Sigma | M9625-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Phenylalanine | Sigma | P2126-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Proline | Sigma | P0380-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Serine | Sigma | S4500-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Threonine | Sigma | T8625-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Tryptophan | Sigma | T0254-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Tyrosine | Sigma | T3754-100G | for complete minimal dropout medium |
| L-Valine | Sigma | V0500-100G | for complete minimal dropout medium |
| myo-Inositol | Sigma | I5125-100G | for complete minimal dropout medium |
| Uracil | Sigma | U0750-100G | for complete minimal dropout medium |
| Ammonium Sulfate | Fisher Scientific | A702-500 | for complete minimal dropout medium |
| Yeast Nitrogen Base | Fisher Scientific | DF0919-07-3 | for complete minimal dropout medium |
| 5-Fluoroorotic acid (5-FOA) | AmericanBio | AB04067-00005 | for 5-FOA medium |
References
- Luger, K., Mader, A. W., Richmond, R. K., Sargent, D. F., Richmond, T. J. Crystal structure of the nucleosome core particle at 2.8 A resolution. Nature. 389 (6648), 251-260 (1997).
- Campos, E. I., Reinberg, D. Histones: annotating chromatin. Annu Rev Genet. 43, 559-599 (2009).
- Rando, O. J., Winston, F. Chromatin and transcription in yeast. Genetics. 190 (2), 351-387 (2012).
- Duina, A. A., Miller, M. E., Keeney, J. B. Budding yeast for budding geneticists: a primer on the Saccharomyces cerevisiae model system. Genetics. 197 (1), 33-48 (2014).
- Storici, F., Resnick, M. A. Delitto perfetto targeted mutagenesis in yeast with oligonucleotides. Genet Eng (N Y). 25, 189-207 (2003).
- Gray, M., Kupiec, M., Honigberg, S. M. Site-specific genomic (SSG) and random domain-localized (RDL) mutagenesis in yeast. BMC Biotechnol. 4, 7 (2004).
- Erdeniz, N., Mortensen, U. H., Rothstein, R. Cloning-free PCR-based allele replacement methods. Genome Res. 7 (12), 1174-1183 (1997).
- Brachmann, C. B., et al. Designer deletion strains derived from Saccharomyces cerevisiae S288C: a useful set of strains and plasmids for PCR-mediated gene disruption and other applications. Yeast. 14 (2), 115-132 (1998).
- Lundblad, V., Hartzog, G., Moqtaderi, Z. Manipulation of cloned yeast DNA. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 13, (2001).
- Hoffman, C. S. Preparation of yeast DNA. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 13, (2001).
- Treco, D. A., Lundblad, V. Preparation of yeast media. Curr Protoc Mol Biol. Chapter 13, (2001).
- Lederberg, J., Lederberg, E. M. Replica plating and indirect selection of bacterial mutants. J Bacteriol. 63 (3), 399-406 (1952).
- Sikorski, R. S., Hieter, P. A system of shuttle vectors and yeast host strains designed for efficient manipulation of DNA in Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 122 (1), 19-27 (1989).
- Johnson, P., et al. A systematic mutational analysis of a histone H3 residue in budding yeast provides insights into chromatin dynamics. G3 (Bethesda). 5 (5), 741-749 (2015).
- DiCarlo, J. E., et al. Genome engineering in Saccharomyces cerevisiae using CRISPR-Cas systems. Nucleic Acids Res. 41 (7), 4336-4343 (2013).
- Cross, S. L., Smith, M. M. Comparison of the structure and cell cycle expression of mRNAs encoded by two histone H3-H4 loci in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol. 8 (2), 945-954 (1988).
- Libuda, D. E., Winston, F. Amplification of histone genes by circular chromosome formation in Saccharomyces cerevisiae. Nature. 443 (7114), 1003-1007 (2006).
