प्रोटोकॉल hPSC उत्परिवर्ती iCRISPR मंच का उपयोग कर लाइनों उत्पन्न करने के लिए और ग्लूकोज उत्तरदायी β-तरह की कोशिकाओं में hPSCs अंतर करने के लिए वर्णित हैं। hPSC निर्देशित भेदभाव के साथ जीनोम संपादन प्रौद्योगिकी के संयोजन मानव विकास और रोग प्रगति में वंश निर्धारकों की भूमिका के व्यवस्थित विश्लेषण के लिए एक शक्तिशाली मंच प्रदान करता है।
स्वयं renewing या मानव स्टेम कोशिकाओं फर्क (hPSCs) में पूछताछ जीन समारोह मानव विकास को समझने और एक थाली में रोग तंत्र विदारक की दिशा में एक बहुमूल्य मंच प्रदान करता है। इस संभावित आवेदन को भुनाने के लिए रोग से जुड़े जीन में hPSC म्यूटेंट, साथ ही इन विट्रो hPSC भेदभाव प्रोटोकॉल उत्पन्न करने के लिए रोग-प्रासंगिक प्रकार की कोशिकाओं है कि निकट उनके vivo समकक्षों पुनरावृत्ति का उत्पादन करने के लिए कुशल जीनोम संपादन उपकरण की आवश्यकता है। ICRISPR नामित hPSCs के लिए एक कुशल जीनोम संपादन मंच AAVS1 लोकस में एक Cas9 अभिव्यक्ति कैसेट की TALEN की मध्यस्थता लक्ष्य-निर्धारण के माध्यम से विकसित किया गया है। इधर, inducible Cas9 hPSC एक रासायनिक परिभाषित मध्यम और एक फीडर मुक्त हालत में संवर्धित कोशिकाओं का उपयोग कर लाइनों की पीढ़ी के लिए प्रोटोकॉल वर्णित हैं। जीन पीटा या hPSCs में सटीक आनुवंशिक परिवर्तन के लिए iCRISPR प्रणाली का उपयोग करने के लिए विस्तृत प्रक्रिया है, या तो n के माध्यम सेपर मुताबिक़ अंत में शामिल होने के (NHEJ) या एक अनुरूपता निर्देशित मरम्मत (एचडीआर) टेम्पलेट का उपयोग कर सटीक न्यूक्लियोटाइड परिवर्तन के माध्यम से, क्रमश: शामिल किए गए हैं। इन तकनीकी प्रक्रियाओं डिजाइन, उत्पादन का विवरण, और CRISPR गाइड आरएनए (gRNAs) के अभिकर्मक शामिल हैं; T7E1 या RFLP संसाधनों द्वारा CRISPR उत्परिवर्तन दर की माप; और स्थापना और प्रतिरूप उत्परिवर्ती लाइनों के मान्यकरण। अंत में, हम क्रॉनिकल विवो अग्नाशय भ्रूण के विकास में नकल उतार द्वारा ग्लूकोज उत्तरदायी अग्नाशय β-तरह की कोशिकाओं में hPSC भेदभाव के लिए प्रक्रियाओं। निर्देशित hPSC भेदभाव के साथ iCRISPR प्रौद्योगिकी का मेल अग्नाशय के विकास और मधुमेह रोग तंत्र के बारे में हमारी समझ को आगे करने के लिए जीन समारोह का व्यवस्थित परीक्षा में सक्षम बनाता है।
मानव स्टेम कोशिकाओं (hPSCs) करने की क्षमता है दोनों आत्म नवीकरण और तीन भ्रूण रोगाणु प्रजातियों के सभी डेरिवेटिव को जन्म दे। वे एक मानव विकास के संदर्भ में सेलुलर प्रक्रियाओं पुनरावृत्ति के लिए एक अनूठा मंच के रूप में सेवा करके सेल रिप्लेसमेंट थेरेपी और रोग मॉडलिंग के लिए एक मूल्यवान संसाधन प्रदान करते हैं। उन्होंने यह भी स्केलेबल, उच्च throughput विश्लेषण के लिए प्रयोगात्मक कोशिकाओं का स्रोत रहे हैं। कुशल आनुवंशिक संशोधन उपकरणों की कमी है और एक संस्कृति डिश में जटिल भ्रूण विकास संबंधी कदम recapitulating में कठिनाई: हालांकि, प्रगति के कारण दो मुख्य चुनौतियों सीमित किया गया है।
आनुवंशिक संशोधन सामान्य विकास और रोग में जीन समारोह का अध्ययन करने के लिए एक अनिवार्य उपकरण है। हालांकि, जबकि शास्त्रीय जीन मुताबिक़ पुनर्संयोजन के माध्यम से दृष्टिकोण को लक्षित कर सिद्ध कर दिया है माउस भ्रूणीय स्टेम कोशिकाओं (mESCs) में जीन समारोह काटना के लिए एक शक्तिशाली उपकरण 1, इस दृष्टिकोण होना करने के लिएजब hPSCs 2, 3 के लिए लागू बेहद अक्षम कर दिया गया है। प्रोग्राम, साइट विशेष प्रयोगशाला में प्रयोग करने के लिए प्रकृति से न्युक्लिअसिज़, जस्ता उंगली न्युक्लिअसिज़ (ZFNs), प्रतिलेखन उत्प्रेरक की तरह प्रेरक न्युक्लिअसिज़ (TALENS), और क्लस्टर नियमित रूप से interspaced कम मुरजबंध संबंधी दोहराता (CRISPR) / CRISPR जुड़े सहित हाल के तेज परिग्रहण (कैस) सिस्टम 4, इसका मतलब है कि जीनोम इंजीनियरिंग जीवों और सेल लाइनों की एक विस्तृत श्रृंखला में एक बहुत आसान काम बन गया है hPSCs में भी शामिल है। ये जीन संपादन उपकरण तथ्य का लाभ लेने के लिए इस तरह के Cas9 endonuclease के रूप में chimeric न्युक्लिअसिज़ सक्रिय करने के लिए या तो गैर मुताबिक़, सटीक स्थानों पर डबल असहाय टूटता है (DSBs) उत्प्रेरण अंतर्जात डीएनए की मरम्मत मशीनरी ट्रिगर द्वारा आनुवंशिक संशोधन की एक पूरी श्रृंखला अनुमति कर सकते हैं कि अंत में शामिल होने के (NHEJ) या अनुरूपता निर्देशित मरम्मत (एचडीआर)। दोनों तंत्र eith उत्प्रेरण द्वारा आनुवंशिक हेरफेर के लिए शोषण किया जा सकता हैएर यादृच्छिक प्रविष्टि और विलोपन म्यूटेशन (indels; NHEJ के माध्यम से), frameshift उत्परिवर्तन है कि जीन alleles, या सटीक न्यूक्लियोटाइड प्रतिस्थापन (एचडीआर के माध्यम से) उठा देना बनाने के लिए, मानव रोग मॉडलिंग के लिए रोगी म्यूटेशन पुनरावृत्ति करने के लिए या जीन थेरेपी के लिए एक रोग के कारण उत्परिवर्तन सही करने के लिए ।
लगातार आरएनए निर्देशित Cas9 endonuclease डीएनए दरार और एक चर CRISPR आरएनए (crRNA) और ट्रांस-सक्रिय (tracrRNA) द्वैध के लिए आवश्यक है कि डीएनए लक्ष्य मान्यता निर्दिष्ट करता है: CRISPR / कैस की मध्यस्थता जीनोम इंजीनियरिंग के दो घटकों की आवश्यकता है। CrRNA / tracrRNA द्वैध एक भी कैमेरिक गाइड आरएनए (gRNA) है, जो और अधिक कुशलता से 5, 6, 7 काम मिल गया है के साथ बदला जा सकता है। CRISPR / Cas9 प्रणाली सबसे प्रायोगिक जीवों और सेल लाइनों, वितरण और की Cas9 और gRNA काफी भिन्न होता है अभिव्यक्ति के लिए अनुकूलित किया गया है और जरूरत आगे achi करने के लिए अनुकूलित किया जानाhPSCs 8 सहित कई प्रणालियों, में पूर्व संध्या कुशल जीनोम संपादन। एक कुशल जीनोम संपादन मंच, iCRISPR, hPSCs 5 में स्थापित किया गया है। इस प्रणाली में, एक TALEN की मध्यस्थता दृष्टिकोण (TRE एक रिवर्स टेट्रासाइक्लिन नियंत्रित transactivator (M2rtTA) और एक टेट्रासाइक्लिन प्रतिक्रिया तत्व के साथ दूसरे के साथ पार, एक एलील में "ट्रांस्जीन सुरक्षित बंदरगाह ठिकाना" AAVS1 के दोनों alleles निशाना बनाने के लिए इस्तेमाल किया गया है ) hPSCs में Cas9 (iCas9 की अभिव्यक्ति) चला। स्थापित प्रतिरूप लाइनों (iCas9 hPSCs) में, Cas9 अत्यधिक डॉक्सीसाइक्लिन उपचार के साथ व्यक्त किया है। इस बीच, अपने छोटे आकार की वजह से (100 NT), एकल या एकाधिक gRNAs आसानी से iCas9 hPSCs में उच्च दक्षता के साथ दिया जा सकता है और साइट विशेष दरार के लिए Cas9 प्रत्यक्ष कर सकते हैं, के रूप में एचडीआर की मध्यस्थता, कुशल NHEJ की मध्यस्थता जीन व्यवधान सक्षम करने के रूप में अच्छी तरह से लघु एकल असहाय डीएनए (ssDNA) दाता टेम्पलेट्स की उपस्थिति में सटीक न्यूक्लियोटाइड संशोधनों। iCRISPR प्रणाली हो सकता हैसफलतापूर्वक, 9 महत्वपूर्ण विकासात्मक जीन 5 में biallelic (homozygous या यौगिक विषमयुग्मजी) या विषमयुग्मजी नुकसान के समारोह के परिवर्तन के साथ रोग नकल उतार hPSC लाइनों के एक पैनल उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया। जबकि समूहों की एक संख्या hPSCs में CRISPR / कैस का उपयोग कर कुशल जीन संपादन सूचना दी है, सफलता तकनीकी रूप से दक्ष प्रयोगशालाओं की एक छोटी संख्या को सीमित रहता है। ICRISPR मंच अलग कौशल के स्तर के शोधकर्ताओं द्वारा दिनचर्या जीन संपादन के लिए एक कुशल अभी तक सरल समाधान प्रदान करता है, और यह पहले से ही हमारे समूह और दूसरों को 9, 10, 11, 12 के द्वारा प्रकाशित अध्ययन की एक संख्या में इस्तेमाल किया गया है। यह दृष्टिकोण भी दिया आगे dCas9-KRAB 13 की अभिव्यक्ति के आधार पर inducible मुंह बंद करने के लिए बढ़ा दिया गया है।
जीनोम संपादन तकनीकी में प्रगति के साथ-साथसना हुआ, महत्वपूर्ण सुधार भी hPSC रखरखाव और निर्देशित भेदभाव में हासिल किया गया है। HPSCs के लिए संस्कृति की स्थिति विकिरणित माउस भ्रूण fibroblast (iMEF) फीडर पर निर्भर परिभाषित बाह्य मैट्रिक्स घटकों पर फीडर मुक्त परिस्थितियों को और जटिल मीडिया योगों से रासायनिक परिभाषित करने के लिए माध्यम की स्थिति 14 से विकसित किया है। इस तरह के सुधार iMEF तैयारी और नॉकआउट सीरम रिप्लेसमेंट घटकों में बैच को बैच मतभेद के कारण hPSCs में परिवर्तनशीलता कम कर दिया है, और इस तरह hPSC भेदभाव के लिए एक अधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य वातावरण प्रदान करते हैं। इस बीच, उच्च throughput दवा स्क्रीनिंग से मानव भ्रूण के विकास के शासी रास्ते, साथ ही खोजों संकेत का बेहतर ज्ञान, सुधार भेदभाव प्रोटोकॉल 15, 16, 17, 18 के लिए मार्ग प्रशस्त किया है। इन प्रोटोकॉल और अधिक बारीकी से viv में नकलओ विकासात्मक कदम और सेल प्रकार है कि निकट उनके vivo समकक्षों पुनरावृत्ति उत्पन्न करते हैं। अग्नाशय के वंश में hPSC भेदभाव के लिए, प्रारंभिक प्रोटोकॉल जल्दी अग्नाशय विकास अपेक्षाकृत अच्छी तरह से लेकिन अंततः polyhormonal β कोशिकाओं है कि अपरिपक्व भ्रूण phenotypes के थे और ग्लूकोज उत्तेजना को खराब प्रतिक्रिया व्यक्त उत्पन्न मजाक उड़ाया। हाल की प्रगति 16, 17, 19, 20 ग्लूकोज उत्तरदायी अग्नाशय β कोशिकाओं की तरह है, जो हमें इस तरह के गठन और monohormonal β कोशिकाओं के आगे परिपक्वता के रूप में बाद की घटनाओं, जांच करने के लिए सक्षम हो जाएगा की पीढ़ी के लिए अनुमति दी है।
यहाँ, हम विस्तार से ग्लूकोज उत्तरदायी pancr की ओर hPSC आधारित इन विट्रो भेदभाव मंच के साथ iCRISPR प्रणाली के संयोजन से अग्नाशय के विकास के अध्ययन के लिए जीनोम संशोधित लाइनों के आवेदनeatic β कोशिकाओं की तरह। एक बेहतर hPSC भेदभाव प्रोटोकॉल के साथ शक्तिशाली जीनोम संपादन उपकरण की इस युग्मन न केवल गति और पैमाने आवश्यक रोग करणीय मान्य करने के लिए बढ़ती मांग को पूरा करने के लिए प्रदान करता है, लेकिन यह भी सामान्य विकास और रोग 9 अंतर्निहित transcriptional नियंत्रण में आगे यंत्रवत जांच के लिए परिष्कृत आनुवंशिक जोड़तोड़ में सक्षम बनाता है ।
जनरेटिंग उत्परिवर्ती लाइन्स के लिए समय विचार
हालांकि हाल के जीनोम संपादन के लिए CRISPR / कैस सिस्टम पर आधारित दृष्टिकोण सफल लक्ष्य-निर्धारण करने के लिए नेतृत्व किया है, एक और अधिक प्रभावशाली और सार्वभौमिक मंच जीन समारोह का विश्लेषण करती है बड़े पैमाने पर करने के लिए बेहतर होगा। ICRISPR मंच ब्याज 5, 9 में से किसी के जीन के म्यूटेशन को पेश करने के लिए एक तेजी से और कारगर तरीका प्रदान करता है। सबसे पहले, पीसीआर आधारित gRNA संश्लेषण विधि समय लेने वाली क्लोनिंग कदम के बिना एक दिन में arrayed प्रारूप में gRNAs के सैकड़ों के उत्पादन की अनुमति देता है। दूसरा, iCas9 hPSCs में डॉक्सीसाइक्लिन-inducible Cas9 अभिव्यक्ति के साथ, gRNA अभिकर्मक से जुड़े कदम केवल काम की एक न्यूनतम राशि की आवश्यकता है, और इस तरह, कई gRNA को निशाना प्रयोगों समवर्ती आयोजित किया जा सकता है। तीसरा, उच्च लक्ष्य-निर्धारण के कारण क्षमता हमारी प्रणाली के विश्लेषण के साथ प्राप्य ~ 24 – ट्रांसफ़ेक्ट gRNA प्रति 48 कालोनियों suff होना चाहिएicient, एक जीन के लिए कई monoallelic और biallelic उत्परिवर्ती लाइनों की स्थापना करने के लिए हालांकि क्षमता लक्ष्य लोकस पर निर्भर करता है। चूंकि यह संभव है के लिए एक प्रशिक्षित व्यक्ति यंत्रवत्, एक ही बार में 384 कालोनियों (4 एक्स 96 अच्छी तरह प्लेटें) लेने जो एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत ~ 4 घंटे के लिए ले जाना चाहिए करने के लिए, एक प्रशिक्षित व्यक्ति के भीतर 12 जीन को प्रभावित करने उत्परिवर्ती लाइनों उत्पन्न करने की उम्मीद की जा सकती है 12 महीने। एक कम समय में hPSC म्यूटेंट के सुव्यवस्थित पीढ़ी प्रतिलेखन कारक और / या संकेतन मार्ग घटक है कि एक दूसरे के साथ बातचीत, विकास की प्रक्रिया 9 को विनियमित करने की एक सरणी के व्यवस्थित विश्लेषण के लिए अनुमति देता है। इसके अतिरिक्त, कुशल मल्टिप्लेक्स जीन लक्ष्यीकरण भी आनुवंशिक बातचीत अंतर्निहित जटिल मानव के लक्षण की जांच करने के लिए दरवाजे खोलता है।
सटीक आनुवंशिक संशोधन की पीढ़ी
आसानी से सुलभ दैहिक कोशिका प्रकार से रोगी विशेष IPSCs की व्युत्पत्ति s और रोग-प्रासंगिक प्रकार की कोशिकाओं में भेदभाव की बीमारी से जुड़े म्यूटेशन के कार्यात्मक सत्यापन के लिए एक महान अवसर प्रदान करते हैं। हालांकि, व्यक्तियों के बीच आनुवंशिक पृष्ठभूमि में काफी परिवर्तनशीलता के कारण, रोगियों से IPSCs के बीच और स्वस्थ दाताओं से प्रत्यक्ष तुलना एक पृष्ठभूमि प्रभाव से रोग phenotypes भेद करने के लिए अनुमति नहीं हो सकती। इसलिए, यह रोग उत्परिवर्तन वापस जंगली प्रकार के अनुक्रम को सही करने से isogenic नियंत्रण IPSCs उत्पन्न करने के लिए या दूसरों के रूप में 25, 26 द्वारा प्रस्तावित है, एक जंगली प्रकार hPSC पृष्ठभूमि में रोगी विशेष म्यूटेशन लागू करने के लिए आवश्यक है। नुकसान के समारोह (शून्य) म्यूटेशन के अलावा, एक अब और अधिक ठीक रोग तंत्र एक रोगी विशेष अनुक्रम परिवर्तन की शुरूआत के माध्यम hPSCs में अंतर्जात ठिकाना, hypermorphic hypomorphic, neomorphic, या प्रमुख नकारात्मक रोगी सहित में काटना सकता है म्यूटेशन।
ntent "> सटीक आनुवंशिक संशोधन एक की मरम्मत टेम्पलेट की उपस्थिति में डीएसबी मरम्मत के लिए एचडीआर कार्यरत हैं। चूंकि यह NHEJ की मध्यस्थता डीएनए की मरम्मत की तुलना में काफी कम कुशल है, एक दाता रोगी विशेष उत्परिवर्तन, एक दवा चयन कैसेट, और अनुरूपता हथियार युक्त प्लाज्मिड पहले से मरम्मत टेम्पलेट 2 के रूप में इस्तेमाल किया गया है। दवा चयन और रोगी विशेष उत्परिवर्तन के सत्यापन के बाद, एक दूसरे चरण के लिए आम तौर पर दवा चयन कैसेट निकालने की जरूरत है। सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल Cre पर loxP और FLP-FRT सिस्टम पीछे छोड़ जब अंतर्जात ठिकाना में अवशिष्ट अनुक्रम, piggyBac transposon के उपयोग दवा चयन कैसेट 27 की निर्बाध हटाने के लिए अनुमति दी गई है। हाल ही में, कम ssDNA टेम्पलेट्स भी इंजीनियर डीएनए endonucleases 28 के साथ कुशल एचडीआर समर्थन करने के लिए दिखाया गया है। एक दाता प्लाज्मिड की तुलना , ssDNA सीधे संश्लेषित किया जा सकता है और इस तरह समय लेने वाली क्लोनिंग कदम गतिरोध उत्पन्न। यहाँ, यह हो गया हैएन पता चला है कि, सह transfecting gRNA और एक ssDNA टेम्पलेट अनुरूपता निर्देशित मरम्मत के लिए प्रेरित करने, iCRISPR उच्च दक्षता के साथ विशिष्ट न्यूक्लियोटाइड संशोधनों के लागू करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। यह केवल, लेकिन यह भी मानव रोग म्यूटेशन मॉडलिंग और संभावित चिकित्सीय हस्तक्षेप के लिए इन रोग से जुड़े म्यूटेशन को सही करने के लिए प्रोटीन कार्यात्मक डोमेन के भीतर आवश्यक न्यूक्लियोटाइड की भूमिका विदारक नहीं करने के लिए महत्वपूर्ण है। संवेदनशीलता लोकी की बड़ी संख्या है कि प्रत्येक एकाधिक अनुक्रम वेरिएंट के साथ जुड़े रहे हैं, मधुमेह जैसे जटिल और multigenic रोगों मॉडलिंग के कारण आनुवांशिकी के लिए एक चुनौती रहा है। जैसा कि iCRISPR मंच एक allelic श्रृंखला का तेजी से पीढ़ी के लिए या multiplexable जीन लक्ष्यीकरण के लिए अनुमोदक है, यह कई बीमारियों से जुड़े स्थलों की जांच की सुविधा कर सकते हैं, या तो व्यक्तिगत रूप से या isogenic पृष्ठभूमि के साथ संयोजन में।क्षमता और बंद लक्ष्य प्रभाव लक्ष्य निर्धारण
हमारे पास है T7E1 और RFLP परख परिणाम और अनुक्रमण द्वारा की पहचान उत्परिवर्ती लाइनों की संख्या के बीच एक अच्छा संबंध पाया गया। इस प्रतिरूप लाइनों की स्थापना के साथ समानांतर में इन assays के प्रदर्शन के महत्व पर जोर दिया। सबसे एकल जीन को निशाना प्रयोगों में जीनोमिक लोकी के आधार पर भिन्न हो सकते हैं, प्राप्त कर ली को निशाना क्षमता, 20 जबकि – क्लोन का 60% दोनों alleles उत्परिवर्तित के साथ पाए गए (सहित और frameshift म्यूटेशन फ्रेम में) 9। मामलों में जहां मल्टिप्लेक्स जीन लक्ष्यीकरण प्रदर्शन किया गया था, 5-10% क्षमता के साथ ट्रिपल biallelic उत्परिवर्ती क्लोन 5 प्राप्त किया गया। 10% 5 – कई जीनों की ssDNA की मध्यस्थता एचडीआर भी homozygous प्राप्त करने तोड़े में 1 से लेकर क्लोन की क्षमता के साथ, सटीक आनुवंशिक परिवर्तन प्राप्त करने के लिए प्रदर्शन किया गया। संभावित बंद लक्ष्य साइटों है कि एक ही gRNA लक्ष्य अनुक्रम का हिस्सा नहीं है में hPSCs में CRISPR / कैस के साथ कार्य करना, किसी भी म्यूटेशन अभी तक पता लगाया जा रहे हैंलड़की = "xref"> 5, 9, 12। पूरे जीनोम हाल के एक अध्ययन में प्रदर्शन किया अनुक्रमण भी CRISPR / कैस 29 का उपयोग कर उत्पन्न प्रतिरूप hPSC लाइनों में पर्याप्त बंद लक्ष्य म्यूटेशन की पहचान करने में नाकाम रही है। फिर भी, बंद लक्ष्य प्रभाव स्थलों पर म्यूटेशन द्वारा शुरू की phenotypes confounding के किसी भी संभावित प्रभाव को कम करने के लिए, यह कम से कम दो स्वतंत्र एक ही जीन के भीतर विभिन्न दृश्यों को निशाना gRNAs का उपयोग कर स्वतंत्र उत्परिवर्ती लाइनों उत्पन्न करने के लिए सुझाव दिया है। इसी तरह के कई लाइनों में मनाया phenotypes मुख्यतः संभावना है कि phenotype एक बंद लक्ष्य प्रभाव से आता शासन से बाहर कर सकता है अलग gRNAs का उपयोग कर उत्पन्न।
फीडर पर निर्भर बनाम स्वतंत्र संस्कृति और लक्ष्य निर्धारण
hPSC संस्कृति के लिए पारंपरिक तरीकों सीरम या सीरम रिप्लेसमेंट कि पशु ठेस शामिल युक्त मीडिया में फीडर कोशिकाओं पर उनके रखरखाव और विस्तार शामिलऐसे गोजातीय सीरम albumin के रूप में ठेस। फीडर कोशिकाओं, सीरम, सीरम रिप्लेसमेंट, और सभी एल्बुमिन जटिल, अपरिभाषित घटक होते हैं और काफी बैच परिवर्तनशीलता दिखा। फीडर से मुक्त और रासायनिक परिभाषित हालत के लिए अनुकूल काफी प्रयासों hPSC रखरखाव के लिए और अधिक महत्वपूर्ण बात, भेदभाव प्रयोगों की स्थिरता बढ़ जाती है कम कर देता है। वर्तमान में, वहाँ बहुत कुछ अध्ययनों कि पूरी तरह से परिभाषित संस्कृति की स्थिति में 30 में संवर्धित hPSCs पर जीनोम संपादन प्रक्रियाओं का वर्णन कर रहे हैं। हम उच्च CRISPR को निशाना क्षमता जब gRNA अभिकर्मक और प्रतिरूप बयान फीडर पर निर्भर संस्कृति की स्थिति की तुलना में फीडर मुक्त परिस्थितियों में प्रदर्शन किया गया पाया है। हम मानते हैं कि इस अभिकर्मक और कॉलोनी गठन के लिए एकल कोशिका बोने के बाद बढ़ सेल अस्तित्व के कारण है। इसके अलावा, फीडर कोशिकाओं पहले अभिकर्मक अभिकर्मकों एकांत में रहना है, जिससे अभिकर्मक दक्षता को कम दिखाया गया है।
संयोजननिर्देशित भेदभाव के साथ जीनोम एडिटिंग
पिछला भेदभाव प्रोटोकॉल केवल इंसुलिन पॉजिटिव कोशिकाओं का एक छोटा सा अंश सामने आए हैं, जिनमें से अधिकांश polyhormonal थे और भ्रूण कोशिकाओं अंत: स्रावी 23 मची। हाल ही में प्रगति और अधिक परिपक्व ग्लूकोज जिम्मेदार बीटा कोशिकाओं की तरह 16, 17, 19, 20 में hPSCs के भेदभाव की अनुमति दी है। हम नियमित रूप से HUES8 hPSCs 9 का उपयोग कम से कम 75% निश्चित एण्डोडर्म कोशिकाओं, 40% Pdx1 + NKX6.1 + अग्नाशय पूर्वज, और 20% के आसपास NKX6.1 + CPEP + ग्लूकोज जिम्मेदार बीटा कोशिकाओं की तरह प्राप्त कर सकते हैं। जब iCRISPR जीनोम संपादन प्रणाली के साथ संयुक्त, इस और अधिक मजबूत भेदभाव प्रोटोकॉल प्रतिलेखन कारक है कि अग्नाशय भेदभाव के अग्नाशय के पूर्वज और अंत: स्रावी चरणों के लिए महत्वपूर्ण हैं के विश्लेषण में मदद की है। यह कर देगायह संभव है, भविष्य के अध्ययनों में, तंत्र है कि मधुमेह 9 आबाद में कार्यात्मक सत्यापन और जांच के लिए उम्मीदवार रोग जीन की एक बड़ी संख्या को जांच करने के लिए।
भविष्य के अनुप्रयोगों या दिशा-निर्देश
हमारे iCRISPR प्रणाली ऐसी माध्यम संवाददाता alleles के निर्माण के रूप में और अधिक जटिल जीनोमिक संशोधनों की पीढ़ी की सुविधा हो सकती एचडीआर की मध्यस्थता जीन लंबे दाता डीएनए टेम्पलेट्स एन्कोडिंग प्रोटीन टैग या फ्लोरोसेंट संवाददाताओं 12 का उपयोग कर निशाना। हम जानते हैं कि पता चला है, उच्च CRISPR लक्षित प्रणाली में प्राप्त क्षमता के कारण, इस प्रक्रिया को आगे दवा चयन 12 के लिए आवश्यकता के बिना, hPSCs में प्रदर्शन किया जा सकता है। इसके अलावा, मल्टिप्लेक्स जीन को निशाना अंतर्निहित जटिल मानव रोग आनुवंशिक बातचीत की जांच करने, के रूप में हमारे हाल के एक अध्ययन है, जो हमें विश्वास है कि इस तरह के काम 31 का पहला उदाहरण है में दिखाया इस्तेमाल किया जा सकता है। आईसीआरआईएसपीआर भी विलोपन बनाने के द्वारा या तो noncoding RNAs में या जीन में इस तरह के प्रमोटरों और enhancers के रूप में विनियामक क्षेत्रों, जीन नियामक नियंत्रण समझने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। कुशलतापूर्वक iCRISPR का उपयोग कर नियामक म्यूटेंट उत्पन्न करने के लिए, gRNAs सहित एक डीएनए बाध्यकारी प्रोटीन के बंधन साइट को बाधित करने के लिए तैयार किया जा सकता है, लेकिन बेसल ट्रांसक्रिप्शनल मशीनरी या एक ऊतक विशेष प्रतिलेखन कारक तक ही सीमित नहीं है। ssDNA टेम्पलेट की मध्यस्थता एचडीआर भी विशिष्ट प्रोटीन बाध्यकारी साइटों रूप बदलना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। अंत में, हम परिकल्पना की गई है कि आगे अनुकूलन जब इन विट्रो भेदभाव प्रोटोकॉल के साथ संयुक्त pluripotency phenotypes या रोग phenotypes के उच्च throughput आनुवंशिक विश्लेषण के लिए hPSCs में iCRISPR मंच का उपयोग सक्षम होगा। ये iCRISPR की मध्यस्थता के अध्ययन के उम्मीदवार रोग से जुड़े जीन और उनके कार्यात्मक प्रासंगिकता के अध्ययन के लिए और अधिक तेजी से पहचान के लिए अनुमति हो सकती है।
The authors have nothing to disclose.
यह काम एनआईएच / NIDDK (R01DK096239) और न्यूयॉर्क राज्य स्टेम सेल साइंस (NYSTEM C029156) द्वारा वित्त पोषित में भाग गया था। ZZ स्लोअन केटरिंग संस्थान के स्टेम सेल बायोलॉजी के लिए केंद्र से NYSTEM postdoctoral फैलोशिप द्वारा समर्थित किया गया।
Chemically defined medium (E8) | Thermo Fisher Scientific | A1517001 | Essential 8 basal medium and Essential 8 supplement included |
Truncated recombinant human form of vitronectin | Thermo Fisher Scientific | A14700 | |
ROCK inhibitor Y-27632 | Selleck Chemicals | S1049 | |
Dissociation reagent (TrypLE Select enzyme) | Thermo Fisher Scientific | 12563029 | 1X, animal origin free, recombinant enzyme |
G418 Sulfate | Thermo Fisher Scientific | 10131035 | Geneticin Selective Antibiotic |
Puromycin dihydrochloride | Sigma-Aldrich | P8833 | Puromycin Selective Antibiotic |
DNA Polymerase (Herculase II Fusion) | Agilent Technologies | 600679 | PCR kit |
MEGAshortscript T7 Transcription kit | Thermo Fisher Scientific | AM1354 | |
MEGAclear Transcription Clean-Up Kit | Thermo Fisher Scientific | AM1908 | |
Doxycycline hyclate | Sigma-Aldrich | D9891 | |
Opti-MEM medium | Thermo Fisher Scientific | 31985062 | Reduced Serum Medium |
Lipofectamine RNAiMAX Transfection Reagent | Thermo Fisher Scientific | 13778150 | |
DNeasy Blood & Tissue Kit | QIAGEN | 69504 | Genomic DNA extraction kit |
Proteinase K | Roche | 3115879001 | |
MCDB 131 medium | Thermo Fisher Scientific | 10372-019 | |
BLAR medium | Thermo Fisher Scientific | Custom-made with a published formulation (Rezania et al., 2014) | |
L-glutamine supplement (GlutaMAX) | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | |
NaHCO3 | Thermo Fisher Scientific | 144-55-8 | |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8769 | |
BSA | LAMPIRE Biological Laboratories | 7500855 | Fatty acid free |
GDF8 | PeproTech | 120-00 | |
CHIR-99021 | Stemgent | 04-0004 | GSK-3 inhibitor |
L-Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4544 | Vitamin C |
FGF7 | R&D Systems | 251-KG | |
SANT1 | Tocris Bioscience | 1974 | Hedgehog inhibitor |
RA | Sigma-Aldrich | R2625 | Retinoic acid |
LDN | Stemgent | 04-0019 | BMP inhibitor |
IWP-2 | Tocris Bioscience | 3533 | Wnt antagonist |
ITS-X | Thermo Fisher Scientific | 51500-056 | |
TPB | EMD Millipore | 565740-1MG | PKC activator |
3,3’,5-Triiodo-L-thyronine (T3) | Sigma-Aldrich | T6397 | |
ALK5i II | Enzo Life Sciences | ALX-270-445 | ALK5 inhibitor II |
ZnSO4 | Sigma-Aldrich | Z0251 | |
Heparin | Sigma-Aldrich | H3149 | |
GSiXX | EMD Millipore | 565789 | Gamma secretase inhibitor XX, NOTCH signaling inhibitor |
N-Cys (N-acetyl cysteine) | Sigma-Aldrich | A9165 | |
Trolox | EMD Millipore | 648471 | Vitamin E analogue |
R428 | Selleck Chemicals | S2841 | AXL receptor tyrosine kinase inhibitor |
24mm Transwell with insert | Corning Life Sciences | 3414 | |
Gene Pulser Xcell Electroporation System | Bio-Rad | 1652660 | |
0.4 cm Electroporation Cuvettes | Bio-Rad | 1652081 | |
AAVS1-TALEN-L | Addgene | 59025 | |
AAVS1-TALEN-R | Addgene | 59026 | |
AAVS1-Neo-M2rtTA | Addgene | 60843 | |
AAVS1-Puro-iCas9 | Addgene | 58409 | |
T7 Endonuclease I | NEB | M0302L | |
Buffer 2 | NEB | B7002S | NEBuffer 2 |
Long oligonucleotide | Eton Bioscience or IDT | ||
SOX17 antibody | R&D Systems | AF1924 | 1: 500 |
FOXA2 antibody | Millipore | 07-633 | 1: 100 |
CXCR4-APC antibody | R&D Systems | FAB170A | 1: 25 |
PDX1 antibody | R&D Systems | AF2419 | 1: 500 |
NKX6.1 antibody | DSHB | F55A12 | 1: 500 |
NKX2.2 antibody | DSHB | 74.5A5 | 1: 100 |
NEUROD1 antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc-1084 | 1: 100 |
Insulin antibody | Dako | A0564 | 1: 2000 |
C-peptide antibody | DSHB | GN-ID4-c | 1: 2000 |
Glucagon antibody | Sigma-Aldrich | G2654 | 1: 1000 |