In Vitro Differensiering av menneskelige pluripotent stamceller til trophoblastic Cells

Summary

Here, we present a protocol to efficiently generate human trophoblastic cells from human pluripotent stem cells using bone morphogenic protein 4 and inhibitors of the Activin/Nodal pathways. This method is suitable for the efficient differentiation of human pluripotent stem cells and can generate large quantities of cells for genetic manipulation.

Abstract

Morkaken er den første orgel til å utvikle under embryogenese og er nødvendig for overlevelsen av utvikling av embryo. Morkaken består av diverse trofoblastisk celler som skiller fra de ekstra-embryonale trophectoderm cellene i preimplantation blastocyst. Som sådan, er vår forståelse av de tidlige differensierings hendelsene i human placenta begrenset på grunn av etiske og juridiske restriksjoner på isolasjon og manipulasjon av menneskelig embryogenese. Humane pluripotente stamceller (hPSCs) er et robust modellsystem for å undersøke humant utvikling og kan også bli differensiert in vitro inn i trofoblastisk celler som uttrykker markører for de forskjellige trophoblast celletyper. Her presenterer vi en detaljert protokoll for å differensiere hPSCs inn trofoblastisk celler ved hjelp av bein morphogenic protein 4 og hemmere av de activin / nodal signalveier. Denne protokollen genererer ulike trophoblast celletyper som kan transfektert med sirnasfor å undersøke tap-av-funksjon fenotyper eller kan være infisert med patogener. I tillegg kan hPSCs genmodifisert og deretter differensiert i trophoblast stamfedre for gevinst-of-funksjonsanalyser. Denne in vitro differensiering metode for generering av menneskelige trophoblasts fra hPSCs overvinner de etiske og juridiske begrensninger ved å jobbe med tidlig menneskelige embryo, og dette systemet kan brukes til en rekke applikasjoner, inkludert medisiner og stamcelleforskning.

Introduction

Morkaken er nødvendig for vekst og overlevelse av fosteret under graviditet og forenkler utveksling av gasser, næringsstoffer, avfallsstoffer og hormoner mellom mors og fosterets sirkulasjon. Den første organ som dannes i løpet av pattedyr embryogenese er placenta, som begynner å utvikle 6-7 dager efter befruktning hos mennesker og 3,5-4,5 dager i mus ^{1, 2, 3, 4.} Trofoblastiske celler er de viktigste cellene i morkaken, og disse cellene representerer en av de tidligste avstamning differensierings hendelsene i pattedyr embryo. De oppstår fra de ytre ekstra-embryonale trophectoderm cellene i preimplantation blastocyst. Vår kunnskap om de tidlige stadiene av morkake utvikling er begrenset av etiske og logistiske begrensninger på modellering tidlig menneskelig utvikling.

Under embryonale implantasjon, trophoblastsinvadere mors epitel og differensiere i spesialiserte stamceller ^5. Cytotrophoblasts (CTBS) er mononukleærerte, udifferensierte stamceller som blandes og differensiere til syncytiotrophoblasts (Syns) og extravillous invasive trophoblasts (EVTs), som anker morkaken til livmor. Syns er multinucleated, terminalt differensierte celler som syntetisere hormoner som er nødvendige for å opprettholde svangerskapet. De tidlige differensiering hendelser som genererer EVTs og Syns er avgjørende for morkakedannelse, som svekkelser i trofoblastisk cellene føre til spontanabort, svangerskapsforgiftning, og intrauterin veksthem ^en. De typer menneskelige trophoblast cellelinjer som er utviklet blant annet foreviget CTBS og choriocarcinomas, som produserer placenta hormoner og vise invasive egenskaper ^6. Primære trofoblastiske celler fra menneske første trimester placentas kan isoleres, men cellene raskt differentiate og stoppe proliferating in vitro. Viktigere, transformert og primære cellelinjer har ulike genuttrykk profiler, noe som indikerer at tumorigen og udødeliggjort trophoblast cellelinjer kanskje ikke nøyaktig representerer primær trophoblasts ^7. I tillegg er disse linjene er usannsynlig å likne morkake trophoblast stamcelle forfedre fordi de er utledet fra senere stadium først gjennom tredje trimester.

Det er et behov for et robust in vitro kultursystem med tidlig stadium humane trofoblaster for å studere de tidlige hendelsene i morkakedannelse og funksjon. Humane embryonale stamceller (hESCs), som deler egenskaper med den indre cellemasse av preimplantasjonsperioden embryo, blir ofte brukt til å modellere tidlig menneskelig utvikling, inkludert dannelsen av de tidlige placenta. Begge menneskeskapte pluripotente stamceller (hiPSCs) og hESCs kan differensieres til trophoblasts in vitro ved hjelp av Bone Morphogenic Protein 4 (BMP4) ^{8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15.} Denne omdannelse av pluripotente celler til trofoblastisk celler ved hjelp BMP4 er spesifikk for humane celler og er mye brukt for å studere utviklingen av tidlig human placenta fordi den ikke krever tilgang til tidlige humane embryo ^{9, 16.} Nylig ble det oppdaget at tilsetning av inhibitorene A83-01 (A) og PD173074 (P), som blokkerer SMAD2 / 3 og MEK1 / 2 signalveier, øker effektiviteten av hPSC differensiering til trophectoderm-lignende forløpere, hovedsakelig Syns og EVTs, uten omfattende generering av mesoderm, endoderm eller ektoderm celler ^{9, 17} </sup>. Ved hjelp av disse mellom forholdene, hESCs differensiert i 12 dager har lignende genuttrykk profiler som trophectoderm celler isolert fra human blastocyst-stadiet embryoer og skille ut ulike placenta spesifikke veksthormoner, som støtter gyldigheten av denne in vitro modell system ^{9, 11.} Her presenterer vi en detaljert protokoll for in vitro differensiering av hPSCs inn menneskelige trophoblast stamceller ved hjelp BMP4 / A / P kulturmedium. Disse betingelsene produserer rikelig antall celler for en lang rekke anvendelser, inkludert RNA-sekvensering, gen avbrudd ved hjelp av sirnas, patogene infeksjoner, og genetisk modifisering ved hjelp av lipofeksjon-mediert transfeksjon.

Protocol

MERK: For differensiering av enten hESCs eller hiPSCs inn trophoblast stamfedre, hPSCs dyrket på mus embryonale fibroblaster (MEFs) blir overført til mater-frie forhold for to passeringer før oppstart differensiering med BMP4 / A / P. Denne prosessen eliminerer MEF forurensning av differensierte celler. Her presenterer vi en protokoll for hESC differensiering, og den samme protokoll kan anvendes for å hiPSCs. 1. Kultur og gjenoppretting av hESCs på Bestrålte mus embryonale fibroblaster (MEFs) (Preparater) </…

Representative Results

Oversikt over In Vitro Differensiering av hPSCs Denne in vitro differensiering protokollen begynner med udifferensierte hESCs dyrket på MEFs som er overført til mater-frie forhold for en passasje (figur 1A). Mens vi beskrev differensiering av hESCs i denne protokollen, brukte vi denne protokollen for å kunne differensiere hiPSCs inn trophoblastic celler. Overgangen til ekstracellulær matriks…

Discussion

Vi presenterte de grunnleggende trinnene for å differensiere hESCs inn trophoblast stamfedre. Denne protokollen har nylig blitt optimalisert for å raskt skille hESCs med tillegg av aktivin / knutepunktet signale inhibitorer, øke differensieringen til trofoblastisk celler og å unngå generering av mesoderm stamceller, som typisk observeres med BMP4 behandling alene. Den BMP4 modellsystem åpner for undersøkelse av de tidligste stadiene av menneskelig trophoblast avstamning spesifikasjon og ekspansjon. I tillegg er d…

Materials

DMEM/F12	Invitrogen	11330-057
Knock Out Serum Replacement	Invitrogen	10828-028	This is referred to as "serum replacement" in this protocol.
NEAA	Invitrogen	11140-050
FBS	Invitrogen	16000-044
L-Glutamine	Invitrogen	10828-028
Penicillin/Streptomycin	Invitrogen	15140-155
2-Mercaptoethanol	Sigma	M-7522
B-FGF	Millipore	GF-003
DMEM	Invitrogen	11965-118
Dispase	Invitrogen	17105-041
Collagenase Type IV	Invitrogen	17104-019
Rock inhibitor Y27632	Calbiochem	688000
Irradiated CF1 MEFs	GlobalStem	6001G	MEFs can be generated from embryonic day 13.5 embyos and irradiated.
0.22 um syringe filter	Millipore	SLGS033SS
Heracell 150i low oxygen incubator	Heracell/VWR	89187-192	Any tissue culture incubator with capacity to regulate oxygen concentrations is sufficient.
BMP4	R&D Systems	314-BP-01M
A 83-01	R&D Systems	2939/10
PD173074	R&D Systems	3044/10
RNAiMax	Invitrogen	13778150
Trizol	ThermoFisher	15596026	Trizol is used to isolate total RNA.
X-tremeGENE 9	Roche	6365779001
Matrigel	Corning	356231	This is referred to as "extracellular matrix" in this protocol.