इंट्रासेलुलर लक्ष्य निर्धारण इनहिबिटर्स की प्रभावकारिता और cytotoxicity स्क्रीनिंग के लिए सिस्टम<em> माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग</em

Summary

हम, माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग के खिलाफ उपन्यास यौगिकों की खोज intracellular लक्षित करने के लिए और इन-शोरबा बैक्टीरिया के साथ-साथ cytotoxicity बढ़ रही स्तनधारी मेजबान सेल के खिलाफ एक मॉड्यूलर उच्च throughput स्क्रीनिंग प्रणाली विकसित की है।

Abstract

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

Introduction

माइकोबैक्टीरियम क्षयरोग, तपेदिक (टीबी) की प्रेरणा का एजेंट, रुग्णता और मृत्यु दर दुनिया भर के एक प्रमुख कारण है। नशीली दवाओं के प्रति संवेदनशील टीबी एक इलाज बीमारी है जो 6 महीने की अवधि के लिए एक से अधिक एंटीबायोटिक दवाओं की आवश्यकता है। एक इलाज बीमारी होने के बावजूद, टीबी मृत्यु दर 2015 ¹ में 15 लाख होने का अनुमान था। पिछले 10 वर्षों में, वहाँ दवा प्रतिरोधी तपेदिक एम के प्रसार पर चिंता बढ़ रही है। बहुत दबा प्रतिरोधी टीबी (एमडीआर-टीबी) टीबी कि कम से कम आइसोनियाज़िड (INH) और रिफैम्पिसिन (आरएमपी), और सबसे एमडीआर-टीबी उपभेदों भी दूसरी पंक्ति टीबी दवाओं का चयन करने के प्रतिरोधी रहे हैं, इस प्रकार उपचार के विकल्प सीमित के लिए प्रतिरोधी है के रूप में परिभाषित किया गया है । दवा प्रतिरोध के प्रभाव ह्यूमन इम्यूनो वायरस (एचआईवी) के साथ मिलकर संक्रमित रोगियों के इलाज के लिए एक अधिक से अधिक चुनौती बनाएँ; 400,000 रोगियों दुनिया भर में 2015 ¹ में एचआईवी जुड़े टीबी की मृत्यु हो गई। निराश, संयुक्त राज्य अमेरिका के खाद्य एवं औषधि Administराशन पिछले 40 वर्षों ² में एमडीआर-टीबी, bedaquiline के खिलाफ केवल एक नए टीबी दवा को मंजूरी दी है,। बेहतर और कम टीबी उपचारों की खोज के क्षेत्र में अग्रिम तत्काल आदेश टीबी और एमडीआर-टीबी के खिलाफ लड़ाई में आगे रहने के लिए में की जरूरत है।

परंपरागत रूप से, टीबी दवा स्क्रीन विकास माध्यम में इन विट्रो विकास की स्थिति, जिससे यौगिकों बढ़ती संस्कृति से जुड़ जाते हैं और सूक्ष्मजीवों उन्मूलन में उनकी प्रभावशीलता ठोस माध्यम पर कॉलोनी के गठन इकाइयों (CFU) की गणना के द्वारा निर्धारित कर रहे हैं के तहत प्रदर्शन कर रहे हैं। CFU मायने रखता है श्रम गहन काफ़ी समय है, और महंगी हैं के रूप में, विभिन्न अप्रत्यक्ष तरीकों से इस समस्या को कम करने के लिए विकसित किया गया है। इस तरह के तरीके Alamar ब्लू व्यवहार्यता परख ^3, हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP) या luciferase व्यक्त बैक्टीरिया से चमक ⁵ से प्रतिदीप्ति ⁴ के निर्धारण, और कुल एडेनोसाइन ट्रायफ़ोस्फेट के आकलन (ए में शामिलटीपी) ^{6, 7।}

ठेठ टीबी फेफड़े, जहां बैक्टीरिया रहते हैं और वायुकोशीय मैक्रोफेज ⁸ की phagosomes अंदर दोहराने के एम तपेदिक संक्रमण की विशेषता है। सरल में शोरबा प्ररूपी स्क्रीन बाह्य रोगाणुओं के अनुरूप कर सकते हैं; हालांकि, ऐतिहासिक परिप्रेक्ष्य में, मारा एम तपेदिक के खिलाफ यौगिकों इस पद्धति का उपयोग पहचान अक्सर संक्रमण मॉडल में नीचे की ओर सत्यापन चरणों के दौरान अपेक्षाओं पर खरा उतरने में विफल रहते हैं। हमारा प्रस्ताव है कि टीबी दवा सबसे अच्छा एक intracellular मेजबान सेल संक्रमण मॉडल में किया जाता है। फिर भी, intracellular मॉडल उच्च throughput स्क्रीनिंग (HTS) विकास के लिए कई तकनीकी और जैविक बाधाओं पास है। एक बड़ा बाधा संक्रमण प्रक्रिया की जटिलता, कई कदम और द्वारा बाह्य बैक्टीरिया की विस्तृत हटाने धोने के बीच द्वारा उदाहरण है। एक दूसरा बड़ी बाधा लंबा समय फिर से हैquirements, विकास का पता लगाने, सामान्य रूप से CFU संस्कृति प्लेटों पर भरोसा कर के द्वारा किया के रूप में, इस प्रक्रिया को पूर्ण करने के लिए 3 सप्ताह लेता है। CFU मायने रखता है को बदलने के लिए एक समाधान फ्लोरोसेंट बैक्टीरिया के साथ संयोजन में स्वचालित फ्लोरोसेंट माइक्रोस्कोपी द्वारा प्रदान की गई है। हालांकि, इस समाधान के लिए एक प्रारंभिक उपकरण निवेश कई अनुसंधान प्रयोगशालाओं के लिए पहुंच से बाहर है कि आवश्यकता है। एक सरल, कम लागत, और रोग-प्रासंगिक एचटीएस विधि बहुत दवाओं की खोज की प्रक्रिया में वृद्धि होगी।

इस अध्ययन में, हम एक नए, मॉड्यूलर एचटीएस प्रणाली है कि एक तेजी से, और उच्च स्केलेबल, अभी तक किफायती, intracellular एम तपेदिक के खिलाफ यौगिकों की गतिविधि का पता लगाते उपयुक्त परख प्रदान करने के उद्देश्य से है रिपोर्ट। (I) intracellular, (ii) cytotoxicity, और (iii) में शोरबा assays: यह प्रणाली तीन मॉड्यूल से बना है। संयुक्त अंतिम परिणाम कार्रवाई के संभावित मोड के रूप में अतिरिक्त जानकारी के साथ, यौगिक संपत्तियों की एक व्यापक विवरण प्रदान करता है। यह अनुसूचित जातिreening प्रणाली दवा तालमेल ⁹ के विश्लेषण सहित विभिन्न यौगिक पुस्तकालयों कि कार्रवाई की विधा लक्षित करते हैं, के साथ कई परियोजनाओं में इस्तेमाल किया गया है, भोजी ¹⁰ की उत्तेजना, और एम तपेदिक के निषेध -secreted डाह कारक (अप्रकाशित)। कार्रवाई की अज्ञात मोड के यौगिकों भी ¹¹ अध्ययन किया गया है। इस विधि का एक संशोधित संस्करण भी intracellular एम तपेदिक ¹¹ के खिलाफ नए यौगिकों की पहचान करने के लिए प्राथमिक जांच पद्धति के रूप में हमारे औद्योगिक साथी द्वारा अपनाया गया था।

Protocol

1. बैक्टीरियल तनाव और विकास का माध्यम गोजातीय सीरम albumin 25 ग्राम, डेक्सट्रोज की 10.0 ग्राम, और विआयनीकृत जल की 460 एमएल में सोडियम क्लोराइड की 4.05 ग्राम solubilizing द्वारा एल्बुमिन डेक्सट्रोज और नमक शेयर समाधान (एडी…

Representative Results

उच्च throughput intracellular स्क्रीनिंग एम तपेदिक luciferase जीन व्यक्त का उपयोग कर चित्रा 2A और तालिका 1 luminometer द्वारा एकत्र कच्चे डेटा,, रिश्तेदार luminescent इकाइयों (RLU) में व्यक्त …

Discussion

इस अध्ययन का लक्ष्य एम तपेदिक के लिए एक मानव intracellular संक्रमण मॉडल का उपयोग कर एक सरल और लागत प्रभावी एचटीएस विधि बनाने के लिए किया गया था। क्षय रोग एक मानव रोग एम तपेदिक से वायुकोशीय मैक्रोफेज के सं?…

Materials

RPMI 1640	Sigma-Aldrich	R5886
L-glutamine	Sigma-Aldrich	G7513
Fetal bovine serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific	12483020
Middlebrook 7H9	Becton, Dickinson and Company	271210
Tween80	Fisher Scientific	T164
Albumin, Bovine pH7	Affymetrix	10857
Dextrose	Fisher Scientific	BP350
Sodium Chloride	Fisher Scientific	BP358
kanamycin sulfate	Fisher Scientific	BP906
PMA	Sigma-Aldrich	P8139
MTT	Sigma-Aldrich	M2128
N,N-Dimethylformamide (DMF)	Fisher Scientific	D131
1M Hydrocholoric acid (HCl)	Fisher Scientific	351279212
Acetic acid	Fisher Scientific	351269
SDS	Fisher Scientific	BP166
Resazurin	Alfa Aesar	B21187
DMSO	Sigma-Aldrich	D5879
Glycerol	Fisher Scientific	BP229
THP-1	American Type Culture Collection	TIB-202
M. tuberculosis H37Rv
96-well flat bottom white plate	Corning	3917
95-well flat bottom clear plate	Corning	3595
Transparent plate sealer	Thermo Fisher Scientific	AB-0580
Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	Biomate 3
Microplate spectrophotometer	Biotek	Epoch
luminometer	Applied Biosystems	Tropix TR717