System for Effekt og Cytotoksisitet Screening av inhibitorer målretting Intracellulær<em> Mycobacterium tuberculosis</em

Summary

Vi har utviklet en modulær high-throughput screening system for å oppdage nye forbindelser mot Mycobacterium tuberculosis, rettet mot intracellulær og i-buljong voksende bakterier, så vel som cytotoksisitet mot pattedyrvertscellen.

Abstract

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

Introduction

Mycobacterium tuberculosis, det forårsakende middel for tuberkulose (TB), er en ledende årsak til morbiditet og dødelighet over hele verden. Medikament-sensitive TB er en behandle sykdom som krever flere antibiotika for en periode på 6 måneder. Til tross for å være en mulig å behandle sykdom, ble TB dødelighet beregnet til å være 1,5 millioner i 2015 ^1. I de siste 10 år har det vært økende bekymring over forekomsten av legemiddelresistent M. tuberculosis. Multidroge-resistente TB (MDR-TB) er definert som TB som er resistent overfor minst Isoniazid (INH) og Rifampicin (RMP), og de fleste MDR-TB stammer er også motstandsdyktig til å velge andre linjer TB medisiner, og begrenser således behandlingsmuligheter . Virkningene av medikamentresistens skape en større utfordring for behandling av pasienter som er infisert med humant immunsviktvirus (HIV); 400.000 pasienter over hele verden døde av HIV-assosiert TB i 2015 ^en. Skuffende, USA Food and Drug Administrasjon har godkjent bare en ny TB legemiddel mot MDR-TB, bedaquiline, de siste 40 år ^2. Fremskritt i å finne bedre og kortere TB terapi er et presserende behov for å ligge i forkant i kampen mot tuberkulose og MDR-TB.

Tradisjonelt er TB narkotika-skjermer utført under in vitro-vekstbetingelser i vekstmedium, hvorved forbindelser tilsettes til en voksende kultur og deres effektivitet i å utrydde mikroorganismer bestemmes ved å telle kolonidannende enheter (CFU) på fast medium. Som CFU teller er arbeidskrevende, tidkrevende og kostbart, har ulike indirekte metoder er utviklet for å lindre dette problemet. Slike metoder omfatter Alamar blå levedyktighet assay ^3, bestemmelse av fluorescens ⁴ fra grønt fluorescerende protein (GFP) eller luminescens ⁵ fra luciferase-uttrykkende bakterier, og estimering av det totale adenosintrifosfat (ATP) ^{6, 7.}

Typisk TB er karakterisert ved en M. tuberculosis-infeksjon i lungen, hvor bakteriene befinner seg og replikere inne i phagosomes av alveolære makrofager ^8. Den enkle i-buljong fenotypisk skjerm kan passe ekstracellulære patogener; imidlertid, i de historisk perspektiv, treffer forbindelsene overfor M. tuberculosis er identifisert ved hjelp av denne metoden ofte mislykkes i å leve opp til forventningene på nedstrømsvaliderings trinn i infeksjonsmodeller. Vi foreslår at TB stoffet er best utføres i en intracellulær vertscelle infeksjonsmodell. Ikke desto mindre, intracellulære modeller har mange tekniske og biologiske barrierer for high-throughput screening (HTS) utvikling. Et stort hinder er kompleksiteten av infeksjonsprosessen, eksemplifisert ved en rekke trinn, og den omstendelige fjernelse av ekstracellulære bakterier ved i mellom vasking. Et annet stort hinder er den lange tids remelsene, som vekst deteksjon, normalt ved å CFU telling på dyrkingsplater, er en prosess som tar over 3 uker å fullføre. En løsning for å erstatte CFU tellingene har blitt gitt av automatisert fluorescens mikroskopi i kombinasjon med fluoriserende bakterier. Dette krever imidlertid løsningen en innledende utstyr investering som er utenfor rekkevidde for mange forskningslaboratorier. En enkel, billig, og sykdomsrelevant HTS-metoden i stor grad vil forbedre drug discovery prosessen.

I denne studien, rapporterer vi en ny, modul HTS system som tar sikte på å gi en hurtig, og skalerbar, men økonomisk, analyse egnet for å bestemme aktiviteten av forbindelsene overfor intracellulær M. tuberculosis. Dette system er sammensatt av tre moduler: (i) intracellulære, (ii) cytotoksisitet, og (III) i-buljong analyser. Den kombinerte endelige resultatet gir en fullstendig beskrivelse av de sammensatte egenskaper, sammen med ytterligere informasjon med hensyn til potensielle virkningsmåte. dette screening system har vært brukt i flere prosjekter med ulike sammensatte biblioteker som er rettet mot virkningsmåte, inkludert analyse av stoffet synergi ^9, stimulering av autophagy ^10, og inhibering av M. tuberculosis -secreted virulens faktor (upublisert). Forbindelser med ukjent virkningsmekanisme har også blitt studert ^11. En modifisert versjon av denne metode ble også tatt i bruk av vår industripartner som den primære undersøkelsesmetode for å identifisere nye forbindelser for intracellulær M. tuberculosis ^11.

Protocol

1. bakteriestamme og vekstmedium Gjør albumin dekstrose og saltløsning (ADS) ved å løse 25 g bovint serum-albumin, 10,0 g dekstrose, og 4,05 g natriumklorid i 460 ml deionisert vann. Filter-sterilisere ADS og oppbevar ved 4 ° C. Gjør Brook 7H9 buljong ved tilsetning av 4,7 g Brook 7H9 pulver og 2 ml glycerol og 900 ml renset vann. Autoklaver Brook 7H9 kokes ved 121 ° C i 10 minutter, og la den avkjøles til romtemperatur før man går videre. Gjør 7H9ADST ved å tilsette 100 ml ADS og 0,5 ml…

Representative Results

High-throughput screening ved hjelp av intracellulær M. tuberculosis uttrykker luciferasegenet Figur 2A og tabell 1 inneholder de rå data samlet inn av luminometeret, uttrykt i relative enheter (RLU luminescens), som viser virkningen av en økende konsentrasjon av den TB medikament rifampicin på M. tuberculosis inne i THP-1-celler. Figur 2A er et spredningsdi…

Discussion

Målet med denne studien var å skape en enkel og kostnadseffektiv HTS-metoden ved anvendelse av et humant intracellulær infeksjonsmodell for M. tuberculosis. Tuberkulose er en human sykdom karakterisert ved infeksjon av alveolære makrofager av M. tuberculosis. På grunn av biosikkerhet problemer, har forskning som involverer biologiske modeller av både bakterien og vertsceller blitt brukt i det siste. Imidlertid har det vist seg at bruken av surrogat bakterier og ikke-humane modeller er fattige pre…

Materials

RPMI 1640	Sigma-Aldrich	R5886
L-glutamine	Sigma-Aldrich	G7513
Fetal bovine serum (FBS)	Thermo Fisher Scientific	12483020
Middlebrook 7H9	Becton, Dickinson and Company	271210
Tween80	Fisher Scientific	T164
Albumin, Bovine pH7	Affymetrix	10857
Dextrose	Fisher Scientific	BP350
Sodium Chloride	Fisher Scientific	BP358
kanamycin sulfate	Fisher Scientific	BP906
PMA	Sigma-Aldrich	P8139
MTT	Sigma-Aldrich	M2128
N,N-Dimethylformamide (DMF)	Fisher Scientific	D131
1M Hydrocholoric acid (HCl)	Fisher Scientific	351279212
Acetic acid	Fisher Scientific	351269
SDS	Fisher Scientific	BP166
Resazurin	Alfa Aesar	B21187
DMSO	Sigma-Aldrich	D5879
Glycerol	Fisher Scientific	BP229
THP-1	American Type Culture Collection	TIB-202
M. tuberculosis H37Rv
96-well flat bottom white plate	Corning	3917
95-well flat bottom clear plate	Corning	3595
Transparent plate sealer	Thermo Fisher Scientific	AB-0580
Spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	Biomate 3
Microplate spectrophotometer	Biotek	Epoch
luminometer	Applied Biosystems	Tropix TR717