Zell Lineage Analysen und Genfunktion Studien mit Twin-Spot MARCM

Summary

Hier stellen wir ein Protokoll für ein Mosaik Markierungstechnik, die die Visualisierung von Neuronen aus einer gemeinsamen Vorläuferzelle in zwei verschiedenen Farben abgeleitet ermöglicht. Dies erleichtert die neuronale Abstammungslinie Analyse mit der Fähigkeit, Geburts Datierung einzelner Neuronen und das Studium der Genfunktion in den gleichen Neuronen verschiedener Individuen.

Abstract

M osaic eine nalyse mit einem r epressible c ell m Arker (MARCM) ist ein positives Kennzeichnungssystem Mosaik , das in Drosophila Neurobiologie Studien weithin angewandt wurde komplizierte Morphologien darzustellen und die Funktion von Genen in Teilmengen von Neuronen innerhalb ansonsten unmarkierten und unbeirrt zu manipulieren Organismen. Genetische Mosaiken im MARCM System erzeugt werden durch ortsspezifische Rekombination zwischen homologen Chromosomen vermittelten Vorläuferzellen innerhalb Dividieren beide markiert (MARCM Klone) und unmarkierten Tochterzellen während der Mitose zu erzeugen. Eine Erweiterung des MARCM Methode, die so genannte Twin-Spot MARCM (tsMARCM), Etiketten sowohl der Zwillings von einem gemeinsamen Vorläufer mit zwei verschiedenen Farben abgeleiteten Zellen. Diese Technik wurde entwickelt, um das Abrufen nützlicher Informationen aus beiden Hemi-Abstammungslinien zu ermöglichen. Durch umfassend verschiedene Paare von tsMARCM Klone Analyse erlaubt die tsMARCM System mappin neuronale Abstammungslinie hochauflösenderg die genaue Geburtsfolge der markierten Neuronen aus gemeinsamen Vorläuferzellen produziert zu offenbaren. Ferner erstreckt sich die tsMARCM System auch Studien der Genfunktion durch die phänotypische Analyse von identischen Neuronen verschiedener Tiere ermöglicht. Hier beschreiben wir , wie die tsMARCM System anzuwenden Studien der neuronalen Entwicklung in Drosophila zu erleichtern.

Introduction

Das Gehirn, die aus einer großen Anzahl und vielfältige Arten von Neuronen, ausstattet Tiere mit der Fähigkeit, Verfahren zu erkennen und zu Herausforderungen von der Außenwelt zu antworten. Neurone des adulten Drosophila zentralen Gehirn aus einer begrenzten Anzahl von neuralen Stammzellen, die so genannte Neuroblasten (NBS) abgeleitet wird , während der Entwicklung ^{1, 2.} Die meisten der NBS in Gehirn Neurogenese in Drosophila beteiligt laufen asymmetrische Teilung selbst erneuernden NBs und Ganglion Mutterzellen (GMCs) zu erzeugen, und die GMCs dann durch eine weitere Runde der Abteilung gehen zu zwei Tochterzellen zu produzieren, die in Neuronen ³ (Abbildung 1A unterscheiden ). Wegen der Kompliziertheit der neuronalen Morphologie und die Herausforderungen im Zusammenhang mit spezifischen Neuronen identifiziert, eine positive Mosaik Etikettiertechnik, Mosaik-Analyse mit einer repressible Zellmarker (MARCM) wurde erfunden, die visualizat zu ermöglichenIon eines einzelnen Neurons oder einer kleinen Untergruppe von Neuronen aus der Bevölkerung der Umgebung, nicht markierten Neuronen ^4.

MARCM nutzt die Flippase (FLP) / FLP Erkennungsziel (FRT) System ⁴ ortsspezifische Rekombination zwischen homologen Chromosomen in einer Teilungsvorläuferzelle Durchführung eines heterozygoten Allel eines Repressor – Gen, dessen Expression normalerweise hemmt die Expression eines Reportergens zu vermitteln. Nach der mitotischen Teilung werden die rekombinanten Chromosomen in zwei Einzelzellen getrennt ist, so dass eine Zelle homozygot Allele des Repressor-Gen enthält, und die andere Zelle hat kein Repressorgen-die Expression des Reporter in dieser Zelle (und ihre Nachkommen) nicht mehr ⁴ blockiert. Drei klonalen Muster sind in der Regel in einem Experiment gefunden MARCM wenn FLP stochastisch in NBs oder GMCs induziert wird: single-cell und zweizelligen-GMC-Klone, die neuronale Morphologie auf Einzelzell resolutio darstellenn und mehrzelligen-NB – Klone, die aus einer gemeinsamen NB (1B) abgeleitet gesamten morphologischen Muster von Neuronen offenbaren. Die MARCM Technik wurde in Drosophila Neurobiologie Studien weit angewendet worden, einschließlich der neuronalen Typerkennung für die Rekonstruktion des Gehirns weiten Kabelnetze, neuronale Abstammungslinie Analysen in Zellschicksal Spezifikation und neuronalen Morphogenese die Entwicklungsgeschichte von Neuronen, phänotypischen Charakterisierung von Gen – Funktionen beteiligt für die Offenlegung von und Differenzierungsstudien ^{5, 6, 7, 8, 9, 10.} Denn nur herkömmliche MARCM eine der beiden Tochterzellen-Etiketten (und Linien) nach der mitotischen Rekombinationsereignis induziert, möglicherweise nützliche Informationen aus der unmarkierten Seite verloren. Diese Einschränkung schließt die Anwendung der Grund MARCM System hochauflösende Analysen vieler neuronaler Linien, die Zellschicksalen in schnellem Tempo oder Präzision umschalten Analysen von Genfunktionen in identischen Neuronen verschiedener Tiere ^{11, 12.}

Twin-Spot MARCM (tsMARCM) ist ein fortschrittliches System , das von einem gemeinsamen Vorläufer mit zwei verschiedenen Farben abgeleitet Neuronen – Etiketten, die die Rückgewinnung von nützlichen Informationen von beiden Seiten der Doppelzellen ermöglicht, so dass die Begrenzung des ursprünglichen MARCM System zu überwinden ¹¹ ( 2A – 2C). Im tsMARCM System werden zwei RNA – Interferenz (RNAi) -basierte Suppressoren an trans-Stellen von homologen Chromosomen in einer Vorläuferzelle angeordnet sind, und die Expression dieser Suppressoren unabhängig die Expression ihrer jeweiligen Reporter (2B) hemmen. Im Anschluss an die ortsspezifische mitotische Rekombination vermittelt durch das FLP / FRT-System, das two RNAi-basierte Suppressoren getrennt werden in zwei Einzelzellen , die Expression von verschiedenen Reportern (2B) zu ermöglichen. Zwei klonalen Muster, single-Zelle , die mit Single-Zell – Klonen und zwei-cell-GMC zugeordnet mehrzelligen-NB – Klone, werden typischerweise in einem tsMARCM experiment (2C) zu sehen. Information von einer Seite der Doppelzellen abgeleitet sind, können als die Referenz für die andere Seite verwendet werden, wodurch hochauflösende neuralen lineage wie Geburten Datieren des markierten Neuronen Analysen und phänotypische Analyse von identischen Neuronen in verschiedenen Tieren, die für die genaue Untersuchung neuronaler Genfunktion ^{11, 12.} Hier präsentieren wir eine Schritt- für -Schritt – Protokoll beschreibt , wie ein tsMARCM Experiment durchzuführen, die von anderen Laboratorien verwendet werden , können ihr Studium der neuronalen Entwicklung (sowie die Entwicklung von anderen Geweben, wo zutreffend) in Drosophila zu erweitern.

Protocol

1. Erstellen Sie tsMARCM-ready Flies Anwendung des erforderlichen Transgene 11, 13 Generieren Sie die ursprüngliche Version von tsMARCM-ready fliegt von Transgenen, die von einzelnen Fliegen getragen werden 11 (siehe Tabelle 1). Zuführen Standard fly genetische Kreuzungsschemata, die zuvor beschrieben wurden, um 13 mehrere Transgene in den gleichen fly Aktien setzen. In einer …

Representative Results

Das tsMARCM System verwendet worden neuronale Abstammungslinie zu erleichtern Analysen und Genfunktion Studien durch Abrufen wichtiger Informationen zu Neuronen aus gemeinsamen NBs abgeleitet. Das System verwendet worden ist am meisten zu identifizieren (wenn nicht alle) neuronalen Typen, bestimmen die Zellzahl jeder neuronalen Typ, und ermitteln die Geburt Ordnung dieser Neuronen 11, 12, 18 (si…

Discussion

Kritische Schritte im Rahmen des Protokolls

Die Schritte 1.1.1, 1.2.1, 2.3, 2.5 und 3.2 sind von entscheidender Bedeutung für eine gute tsMARCM Ergebnisse zu erhalten. Gewebespezifische -GAL4 Treiber , die 1.1.1 und 1.2.1 für Schritte nicht GAL4 in neuralen Vorläuferzellen exprimieren , werden bevorzugt. Vermeiden Sie die Tiere über Anziehens in den Fly-Lebensmittel Fläschchen in Schritt 2,3 gezüchtet. Da die Induktion Latenz, das Expressionsniveau von FLP auf Hitzeschock, und di…

Materials

Carbon dioxide (CO2)	Local vendor	n.a.	Anesthetize flies
CO2 pad	Local vendor	n.a.	Sort, cross and transfer flies
10x PBS pH 7.4	Uniregion Bio-Tech (or other vendors)	PBS001	Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Formaldehyde	Sigma-Aldrich	252549	Fix fly brains
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	Rinse, wash and immunostain fly brains
Normal goat	Jackson ImmunoResearch	005-000-121	Immunostain fly brains
serum
Rat anti-mouse CD8 antibody	Invitrogen	MCD0800	Immunostain fly brains
Rabbit anti-DsRed antibody	Clonetech	632496	Immunostain fly brains
Mouse anti-Brp antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	nc82	Immunostain fly brains
Goat anti-rat IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11006	Immunostain fly brains
Goat anti-rabbit IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 546	Invitrogen	A11035	Immunostain fly brains
Goat anti-mouse IgG antibody conjugated with Alexa Fluor 647	Invitrogen	A21236	Immunostain fly brains
SlowFade gold antifade reagent	Molecular Probes	S36936	Mount fly brains and protect quenching of fluorescence
PYREX 9 depression glass spot plate	Corning	7220-85	Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Sylgard 184 silicone elastomer kit	World Precision Instruments	SYLG184	Make black Sylgard dishes to protect forceps during brain dissection
Activated charcoal	Sigma-Aldrich	242276-250G	Make black Sylgard dishes
Dumont #5 forceps	Fine Science Tools	11252-30	Dissect and mount fly brains
Micro slide	Corning	2948-75×25	Mount fly brains
Micro cover glass No.1.5	VWR International	48366-205	Mount fly brains
Nail polish	Local vendor	not available	Seal micro cover glass on micro slides
Incubator	Kansin Instruments	LTI603	culture flies at 25°C
	(or other vendors)
Water bath	Kansin Instruments	WB212-B2	Induce heat-shock in flies at 37°C
	(or other vendors)
Orbital shaker	Kansin Instruments	OS701	Wash and immunostain fly brains
	(or other vendors)
Dissection microscope	Leica	EZ4	Sort, cross and transfer flies; Dissect, rinse, wash and immunostain fly brains
Confocal microscope	Zeiss (or other vendors)	LSM 700 (or other models)	Image tsMARCM clones
image-processing software 1 (e.g., Zeiss LSM image browser)	Zeiss	not available	Project stacks of confocal images
image-processing software 2 (e.g., Image-J)	not available	not available	Count cell number of tsMARCM clones