Ein Rapid-Filtereinsatz-basierte 3D-Kultursystem für die primäre Prostata Zelldifferenzierung
Summary
Here, we present a method for the establishment of a rapid in vitro system that supports the three dimensional culturing and subsequent luminal differentiation of primary prostate epithelial cells.
Abstract
Bedingtes umprogrammiert Zellen (CRCs) eine nachhaltige Methode zur primären Zellkultur und die Fähigkeit, umfangreiche "living Biobanken" von Patienten abgeleiteten Zelllinien zu entwickeln. Für viele Typen von Epithelzellen, verschiedene dreidimensionale (3D) Kultur Ansätze beschrieben worden, die eine verbesserte differenzierten Zustand unterstützen. Während CRCs ihre Abstammung Engagement für das Gewebe zu halten, aus dem sie isoliert sind, versagen sie viele der Differenzierungsmarker mit dem Ursprungsgewebe assoziiert auszudrücken, wenn sie unter normalen zweidimensionalen (2D) Kulturbedingungen gezüchtet. Um die Anwendung von Patienten stamm CRCs für Prostatakrebs Forschung verbessern, ein 3D-Kultur-Format definiert wurde, die eine schnelle (2 Wochen insgesamt) luminalen Zelldifferenzierung in normalen und Tumor-abgeleitete Prostata-Epithelzellen ermöglicht. Hierbei wird ein Filtereinsatz basierten Format wird sowohl für die Kultivierung und Differenzierung von normalen und malignen Prostata CRCs beschrieben. A dedetaillierte Beschreibung der Zellenerfassung und -verarbeitung für immunhistochemischen und Immunfluoreszenzanfärbung erforderlichen Verfahren für vorgesehen sind. Zusammengefasst das 3D-Kultur-Format beschrieben, mit den primären CRC-Linien kombiniert wird, liefert einen wichtigen mittel- Durchsatz Modellsystem für High- Bioprobe-basierte Prostata Forschung.
Introduction
Die Identifizierung und Nutzung von Krebstherapien, die auf Einzelpersonen personalisiert sind ein vorrangiges Ziel in der Krebsforschung. Kürzlich wurden neue Konzepte entwickelt, die in die Einrichtung von primären Zellkulturen für größere Leichtigkeit ermöglichen, möglicherweise Weisen sowohl die Identifizierung und Prüfung personalisierten Therapien bieten. Zum Beispiel kann der R-spondin Basis Prostata organoiden Ansatz 1 für dreidimensionale (3D) Kultivierung von normalen und metastatischen Prostatakrebszellen in einer kommerziellen extrazellulären Matrix (beispielsweise Matrigel), während die Bedingter Reprogrammierung von Zellen (CRC) Verfahren an der Georgetown 2 entwickelt, nutzt 3 weitere Standard – 2D – Kulturbedingungen. Insbesondere führen die Kombination aus einem Rho – Kinase – Inhibitor (Y-27632) und bestrahlten J2 Maus – Fibroblasten – Feeder – Zellen auf unbestimmte Zeit Kultivierung von Keratinozyten CRCs 2. Die CRC-Methodik istextrem robust, mit primären Zelllinien erfolgreich etabliert und auf unbestimmte Zeit aus der Prostata und viele andere normalen und malignen epithelialen Geweben 3 gehalten. Wichtig ist, dass unsere CRC-Technologie für die schnelle Identifizierung der ursächlichen Basis für rezidivierende Atemwegs Papillomatose bei einem Patienten erlaubt, die eine Reihe von früheren medikamentösen Behandlungen versagt hatte. Darüber hinaus mit normalen und tumorabgeleiteten CRCs genehmigte die erfolgreiche Identifizierung eines FDA Droge, Vorinostat, wurde innerhalb von zwei Wochen nach der anfänglichen Gewebebiopsie gemacht. Der Patient wurde auf vorinostat platziert, in der erfolgreichen Behandlung ihrer Erkrankung 4 führt.
Die normale Prostata wird von Luminal, basal umfasste und den seltenen neuroendokrinen Zellen 5. Luminalen Zellen bilden die säulen Epithelschicht der Drüse und drücken den Androgen-Rezeptor (AR), sowie andere luminalen Marker wie Zytokeratine 8 und 18 und Prostate-spezifischen Antigens (PSA) 6. Im Gegensatz dazu sind die basale Zellen unterhalb der luminalen Schicht lokalisiert und Zytokeratin 5 und p63 exprimieren, aber geringe Mengen des AR 5. Wir haben 7, 8, 9 und andere 10 haben erfolgreich Prostata CRCs in präklinischen mechanistischen Arzneimittelempfindlichkeit Untersuchungen verwendet. Wenn jedoch unter Standard – 2D – Gewebekulturbedingungen gezüchtet, versagen diese Zellen vollständig AR Signalisierung 10 zu beteiligen. Wichtig ist gesetzt, wenn sie unter die Nierenkapsel von immungeschwächten Mäusen, gewann die CRCs normalen Prostatadrüsen Architektur und Funktion anzeigt, dass Prostata CRCs ihre Abstammung Engagement beibehalten, wenn sie in einer permissiven Umgebung platziert. Die Entwicklung des Filtereinsatzes basierenden Zellkultur hier beschriebene System ermöglicht eine schnelle (2 Wochen) in vitro Differenzierung von Prostata CRCs als belegt by die erhöhte Expression des AR und AR Zielgene sowie verringerte Mengen an p63.
Die Filtereinsätze verwendet werden, enthalten Polycarbonatmembranen (Porengröße 0,4 & mgr; m), die die Kultivierung von Säugetierzellen zu unterstützen. Das System, wie entwickelt, macht Gebrauch von normalen und malignen Prostata CRCs, 6-Well-Kulturschalen und die Filtereinsätze. Zellkulturmedien bedingt durch J2 – Zellen 11 ist in der unteren Kammer und der Prostata Differenzierungsmedien in der oberen Kammer angeordnet. Die hierin beschriebenen Techniken Prostata luminalen Zelldifferenzierung innerhalb einer 2-wöchigen Zeitraum, im Einklang mit den Zielen der personalisierten Medizin zu unterstützen. Es war auch zwingend notwendig, die Methoden zu entwickeln, die für die umfassende molekulare, genetische und zelluläre Profilierung der Kulturen ermöglichen. Ansätze zur Isolierung von DNA, RNA und Protein aus Zellen von der Filteroberfläche gelöst wurden für eine genaue Wiederholungsprobenverarbeitung entwickelt und rationalisiert. Finally, Einbettung zu ermöglichen, die Methode zum Entfernen des Filters erforderlich ist, Schneiden und für H & E, immunhistochemischen und Immunfluoreszenzfärbung wird vollständig beschrieben.
Protocol
Representative Results
Discussion
Primäre Zelllinien sind ein wichtiges und sich schnell entwickelnde Plattform für die Krebsforschung. Die Kultureinsatz-basierte 3D-Kultursystem unterstützt die Differenzierung von primären Prostata CRCs innerhalb einer zweiwöchigen Frist. Der CRC-Filter-Methode stellt eine neue, mittlere Durchsatzverfahren für Prostata-Forschung. Bestehende Maus PDX-Modelle sind zeitaufwendig und extrem teuer, und viele der PDX Proben nicht in Kultur gezüchtet werden, Forschern initiierte Experimente und ihre Nützlichkeit begre…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Forschung wurde von T32 (CA 9686-18) und TL1 (TL1TR001431) Postdoc-Stipendium Auszeichnungen (LT), DOD PC140268 (CA) unterstützt, W81XWH-13-1-0327 (CA) TR000102-04 (CA) sowie U01 PAR-12-095 (Kumar) und P30 CA051008-21 (Weiner). Beispiel Fixierung, Schneiden und Färben wurde in der Lombardi Comprehensive Cancer Center Histologie und Tissue Shared Resource ausgeführt. Wir danken Richard Schlegel für hilfreiche Diskussionen. Der Inhalt ist allein in der Verantwortung der Autoren und stellen nicht notwendigerweise die offizielle Position des National Cancer Institute oder dem National Institutes of Health vertreten.
Materials
| Corning Costar Snapwell Culture Inserts | Corning | 3801 |
| Millicell Cell Culture Inserts | Millipore | PIHP01250 |
| Multiwell 6 Well | Falcon | 353046 |
| Gelatin 0.1% in water | Stemcell Technologies | 7903 |
| Sterile Saftey Scapel 10 Blade | Integra Miltex | 4-510 |
| Sterile Standard Scalpel 11 Blade | Integra Miltex | 4411 |
| RIPA Lysis and Extraction Buffer | Thermofisher Scientific | 89900 |
| Sodium Fluoride | Fishcer Scientific | S299-100 |
| Sodium Vanadate | Fishcer Scientific | 13721-39-6 |
| Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | 3483123 |
| Protease Inhibitor Cocktail (AEBSF, Aprotinin, Bestatin, E-64, Leupeptin and Pepstatin A) | Sigma-Aldrich | P8340 |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1x) | Thermofisher Scientific | 25200-056 |
| DMEM | Thermofisher Scientific | 11965-092 |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 |
| Glutamine | Thermofisher Scientific | 25030081 |
| Penicillin Streptomycin | Thermofisher Scientific | 15140-122 |
| F-12 Nutrient Mix Media | Thermofisher Scientific | 11765054 |
| Y-27632 dihydrochloride Rock inhibitor | Enzo | ALX-270-333-M025 |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich | H0888 |
| EGF | Thermofisher Scientific | PHG0315 |
| Insulin | Thermofisher Scientific | 12585-014 |
| Cholera Toxin | Sigma-Aldrich | C3012 |
| Gentamicin | Thermofisher Scientific | 15710-064 |
| Fungizone | Fisher Scientific | BP264550 |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596026 |
| Histogel Specimen Processing Gel (hydroxyethyl agarose (HEA)) | Thermo Scientific | HG-4000-012 |
| Non-Adherent Dressing | Telfa | KDL2132Z |
| Cell Culture Dish | Sigma | SIAL0167 |
| HISTOSETTE II Tissue Processing / Embedding Cassettes | Crystalgen | CG-M492 |
Riferimenti
- Gao, D., et al. Organoid cultures derived from patients with advanced prostate cancer. Cell. 159 (1), 176-187 (2014).
- Chapman, S., Liu, X., Meyers, C., Schlegel, R., McBride, A. A. Human keratinocytes are efficiently immortalized by a Rho kinase inhibitor. J Clin Invest. 120 (7), 2619-2626 (2010).
- Liu, X., et al. ROCK inhibitor and feeder cells induce the conditional reprogramming of epithelial cells. Am J Pathol. 180 (2), 599-607 (2012).
- Yuan, H., et al. Use of reprogrammed cells to identify therapy for respiratory papillomatosis. N Engl J Med. 367 (13), 1220-1227 (2012).
- Signoretti, S., et al. p63 is a prostate basal cell marker and is required for prostate development. Am J Pathol. 157 (6), 1769-1775 (2000).
- Lang, S. H., Frame, F. M., Collins, A. T. Prostate cancer stem cells. J Pathol. 217 (2), 299-306 (2009).
- Ringer, L., et al. The induction of the p53 tumor suppressor protein bridges the apoptotic and autophagic signaling pathways to regulate cell death in prostate cancer cells. Oncotarget. 5 (21), 10678-10691 (2014).
- Pollock, C. B., et al. Strigolactone analogues induce apoptosis through activation of p38 and the stress response pathway in cancer cell lines and in conditionally reprogrammed primary prostate cancer cells. Oncotarget. 5 (6), 1683-1698 (2014).
- Crogliom, M., et al. Analogs of the Novel Phytohormone, Strigolactone, Trigger Apoptosis and Synergy with PARP1 Inhibitors by Inducing DNA Damage and Inhibiting DNA Repair. Oncotarget. , (2016).
- Saeed, K., et al. Comprehensive Drug Testing of Patient-derived Conditionally Reprogrammed Cells from Castration-resistant Prostate Cancer. Eur Urol. , (2016).
- Palechor-Ceron, N., et al. Radiation induces diffusible feeder cell factor(s) that cooperate with ROCK inhibitor to conditionally reprogram and immortalize epithelial cells. Am J Pathol. 183 (6), 1862-1870 (2013).
- Coffey, A., Johnson, M. D., Berry, D. L. SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks. J Vis Exp. (99), e52868 (2015).
- Hidalgo, M., et al. Patient-derived xenograft models: an emerging platform for translational cancer research. Cancer Discov. 4 (9), 998-1013 (2014).
- Drost, J., et al. Organoid culture systems for prostate epithelial and cancer tissue. Nat Protoc. 11 (2), 347-358 (2016).
