Mammalian Cell Encapsulation in Alginate Beads Using a Simple Stirred Vessel

Corinne A. Hoesli; Roger L. J. Kiang; Kamini Raghuram; Ren&#233; G. Pedroza; Karen E. Markwick; Antonio M. R. Colantuoni; James M. Piret

doi:10.3791/55280

JoVE Journal > Bioengineering

Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.

Bioingegneria

خلايا الثدييات التغليف في أحجار الجينات باستخدام سفينة أثارت بسيطة

Published: June 29, 2017

doi:

10.3791/55280

Corinne A. Hoesli, Roger L. J. Kiang, Kamini Raghuram, René G. Pedroza, Karen E. Markwick, Antonio M. R. Colantuoni, James M. Piret

¹Department of Chemical Engineering,McGill University, ²Michael Smith Laboratories & Department of Chemical and Biological Engineering,University of British Columbia, ³Michael Smith Laboratories & Department of Pharmaceutical Sciences,University of British Columbia

Summary

هذا الفيديو ومخطوطة تصف طريقة مستحلب لتغليف خلايا الثدييات في 0.5٪ إلى 10٪ الخرز الجينات التي يمكن أن تنتج في دفعات كبيرة باستخدام وعاء أثارت بسيطة. يمكن زراعة الخلايا المغلفة في المختبر أو زرعها لتطبيقات العلاج الخلوي.

Abstract

وقد استخدمت تغليف الخلايا في الخرز الجينات لثقافة الخلايا يجمد في المختبر وكذلك ل إمونوسولاتيون في الجسم الحي . وقد تم دراسة تغليف جزيرة البنكرياس على نطاق واسع كوسيلة لزيادة بقاء جزيرة في زرع خيفي أو زينوجينيك. ويتحقق تغليف الألجينات عادة عن طريق قذف فوهة والهلام الخارجي. باستخدام هذه الطريقة، قطرات الجينات التي تحتوي على الخلية تشكلت في غيض من الفوهات تقع في محلول يحتوي على الكاتيونات ثنائي التكافؤ التي تسبب الجيلاتين المؤلمة الاجهاد كما أنها تنتشر في قطرات. شرط تشكيل الحبرية في طرف فوهة يحد من الإنتاجية الحجمي وتركيز الجينات التي يمكن تحقيقها. يصف هذا الفيديو طريقة استحلاب قابلة للتغليف خلايا الثدييات في 0.5٪ إلى 10٪ الجينات مع 70٪ إلى 90٪ البقاء على قيد الحياة الخلية. بواسطة هذه الطريقة البديلة، يتم استحصال قطرات الجينات التي تحتوي على خلايا وكربونات الكالسيوم في الزيوت المعدنية، فولمنخفضا بانخفاض في درجة الحموضة يؤدي إلى الإفراج الداخلي عن الكالسيوم و الجيلاتين المؤلمة. الأسلوب الحالي يسمح لإنتاج الخرز الجينات في غضون 20 دقيقة من الاستحلاب. المعدات المطلوبة لخطوة التغليف تتكون من سفن مقلوبة بسيطة متاحة لمعظم المختبرات.

Introduction

وقد تم دراسة تغليف الخلايا الثدييات على نطاق واسع كوسيلة لحماية الخلايا المزروعة من الرفض المناعي ¹ أو لتوفير دعم ثلاثي الأبعاد لثقافة الخلايا يجمد ² ^، ³ ^، ⁴ . وقد تم استخدام تغليف جزيرة البنكرياس في الخرز الجينات لعكس مرض السكري في خيفي ⁵ ^، ⁶ أو زينوجينيك ⁷ ^، ⁸ ^، ⁹ ^، ¹⁰ ^، ¹¹ ^، ¹² القوارض. التجارب قبل السريرية والسريرية من زرع جزيرة البنكرياس مغلفة لعلاج مرض السكري من النوع 1 مستمرة ¹³ ^، ¹⁴ ^، ¹⁵ . لتطبيقات زرع أو أكبر حجماه في المختبر يجمد إنتاج الخلايا، وتستخدم عموما مولدات حبة مقرها فوهة. عادة، يتم ضخ مزيج من الجينات والخلايا من خلال فوهة لتشكيل قطرات التي تقع في محلول محرض يحتوي على الكاتيونات ثنائي التكافؤ، مما أدى إلى هلام الخارجي للقطرات. تدفق الغاز المحوري ¹⁶ ^، ¹⁷ ، فوهة الاهتزاز ¹⁸ ، كهرباء التنافر ¹⁹ أو الدورية الأسلاك ²⁰ تسهيل تشكيل قطرة في طرف فوهة.

العوائق الرئيسية لمولدات حبة التقليدية هي إنتاجية محدودة ومجموعة محدودة من اللزوجة الحل الذي سيؤدي إلى تشكيل حبة كافية ²¹ . في معدلات تدفق عالية، والسوائل الخروج من فوهة يكسر في قطرات أصغر من قطر فوهة، وانخفاض حجم السيطرة. مولدات متعددة فوهة حبة يمكن استخدامها لزيادة الإنتاجية، ولكنوالتوزيع الموحد للتدفق بين الفتحات واستخدام الحلول> 0.2 باس هو مشكلة ²² . وأخيرا، من المتوقع أن نقل بعض الأضرار التي لحقت الجزر، لأن قطر الفوهات المستخدمة ما بين 100 ميكرون و 500 ميكرون، في حين أن ~ 15٪ من الجزر البشرية يمكن أن يكون أكبر من 200 ميكرون ²³ .

في هذا الفيديو، ونحن تصف طريقة بديلة لتغليف خلايا الثدييات من خلال تشكيل قطرات في خطوة استحلاب واحد بدلا من قطرة عن طريق قطرة. منذ يتم تنفيذ إنتاج حبة في وعاء أثارت بسيطة، وطريقة مناسبة لصغيرة (~ 1 مل) على نطاق واسع (10 ³ L مجموعة) حبة الإنتاج مع انخفاض تكاليف المعدات ²⁴ . هذا الأسلوب يسمح لإنتاج الخرز مع كروية عالية باستخدام مجموعة واسعة من اللزوجة الجينات مع قصيرة (على سبيل المثال 20 دقيقة) حبة جيل مرات. وقد وضعت هذه الطريقة في الأصل من قبل بونسيليت وآخرونل. ²⁵ ^، ²⁶ وتستخدم لتجميد الحمض النووي ²⁷ والبروتينات ²⁸ بما في ذلك الأنسولين ²⁹ ، والبكتيريا ³⁰ . لقد تكييفنا مؤخرا هذه الأساليب لتغليف خلايا الثدييات باستخدام خطوط خلايا بيتا البنكرياس ³¹ ^، ³² وأنسجة البنكرياس الأساسي ³² .

مبدأ الأسلوب هو توليد المياه في النفط مستحلب تتكون من قطرات الجينات في الزيوت المعدنية، تليها هلام الداخلية من قطرات الجينات ( الشكل 1 ). أولا إنكابسولانت (على سبيل المثال، الخلايا) هو فرقت في محلول الجينات تحتوي على غرامة ملح الكالسيوم الحبوب مع ذوبان منخفضة في درجة الحموضة العملية الأولية. ثم تضاف خليط الجينات إلى مرحلة عضوية مهيجة لإنشاء مستحلب، وعادة في وجود التوتر السطحي. في حالة تغليف الخلايا الثدييات، يمكن أن تكون المكونات الموجودة في المصل بمثابة عوامل خافضة للتوتر السطحي. بعد ذلك، يتم تخفيض الرقم الهيدروجيني من أجل ذوبان ملح الكالسيوم بإضافة حمض قابل للذوبان في الزيت الذي يقسم إلى المرحلة المائية. يجب أن يذوب حامض الخليك مع معامل تقطيع الزيت / الماء <0.005 ³³ قبل أن يذوب في الزيت ثم يضاف إلى المستحلب حيث يتم خلطه في طور الزيت ويقسم بسرعة إلى المرحلة المائية ³⁴ . ويوضح الشكل 2 التفاعلات الكيميائية ونشرها التي تحدث أثناء التحمض وخطوة الهلام الداخلية. وأخيرا، يتم استرداد الخلايا المغلفة من قبل انقلاب المرحلة، فصل المرحلة تسارع بواسطة الطرد المركزي، خطوات الغسيل المتكررة والترشيح. ويمكن بعد ذلك اتباع هذه الخطوات من قبل حبة وأخذ العينات خلية لتحليلات مراقبة الجودة، في الخلايا المخبرية ثقافة و / أو زرع الخلايا المغلفة.

الشكل 1: تخطيطي لعملية مستحلب القائم لتغليف خلايا الثدييات. يتم إنتاج الخرز أولا عن طريق استحلاب الجينات والخلايا وكاكو ₃ خليط في الزيوت المعدنية (الخطوات 1 و 2 في التخطيطي)، مما اثار الهلام الداخلي عن طريق إضافة حمض الخليك (الخطوة 3). ثم يتم فصل الخرز التبلور من النفط بإضافة العازلة المائية لتحريك مرحلة الانقلاب (الخطوة 4)، تليها الطرد المركزي وطموح النفط (الخطوة 5)، ثم الترشيح (الخطوة 6). وأخيرا، يتم نقل الخرز التي تم جمعها على مرشح في وسط زراعة الخلايا للفي المختبر الثقافة أو لزرع. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

<imgألت = "الشكل 2" كلاس = "زفيجيمغ" سرك = "/ فيليز / ftp_upload / 55280 / 55280fig2.jpg" />
الشكل 2: ردود الفعل ونشر الخطوات التي تحدث أثناء الهلام الداخلي. (1) يتم إضافة حمض الخليك إلى المرحلة العضوية ويتم نقله إلى قطرات الجينات بالحمل الحراري. (2) أقسام حمض الخليك في المرحلة المائية. (3) في وجود الماء، ينفصل الحمض وينتشر للوصول إلى حبوب الكاكاو _{3 التي} تصور باللون الأزرق الداكن. (4) يتم تبادل الأيونات H ⁺ مع أيونات كا ^{2 +} في كاكو ₃ ، والإفراج عن كا ^{2 +} أيونات. (5) أيونات الكالسيوم منتشر حتى يواجهون الجينات غير المتفاعلة، مما يؤدي إلى الربط عبر اليونوتروبيك لسلاسل الجينات. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

على النقيض من التقليدية إنوابسولاتورس خلية مقرها فوهة، توزيع حجم حبة واسعة هو إكسبكتد من هذه العملية بسبب آلية تشكيل الحبرية في استحلب أثار. بالنسبة لمجموعة فرعية من التطبيقات، قد يكون هذا التوزيع حجم حبة مشكلة. على سبيل المثال، قد يتعرض جزء أكبر من الخلايا في سطح حبة في الخرز أصغر. إذا كانت القيود الغذائية ( مثل الأكسجين) هي مصدر قلق، قد تتفاقم هذه القيود في الخرز أكبر. ميزة من أسلوب استحلب أثار هو أن متوسط حجم حبة يمكن تعديلها بسهولة عن طريق تغيير معدل الإثارة خلال خطوة الاستحلاب. ويمكن أيضا توزيع حجم حبة واسعة يمكن استغلالها لدراسة تأثير حجم حبة على أداء الخلايا مغلفة.

تغليف الخلايا الثدييات عن طريق الاستحلاب والهلام الداخلي هو بديل مثير للاهتمام للمختبرات التي ليست مجهزة مع مولد حبة. وعلاوة على ذلك، وهذا الأسلوب يعطي المستخدمين خيار تقليل وقت المعالجة، أو توليد الخرز في منخفضة جدا أو عالية جدا الجينات كونسنتربالجمع.

بروتوكول موضح أدناه يصف كيفية تغليف الخلايا في 10.5 مل من محلول الجينات 5٪ أعدت في 10 ملم 4- (2-هيدروكسي إيثيل) -1-بيبيرازينيثان سلفونيك حمض (هيبيس) العازلة. يتكون الجينات من خليط 50:50 من لفم الزرع الصف (منخفض اللزوجة عالية محتوى حمض المنورونيك) و مفغ (اللزوجة المتوسطة محتوى حمض غولورونيك عالية) الجينات. كربونات الكالسيوم في تركيز النهائي من 24 ملم يستخدم كعامل الربط عبر المادية. يشكل الزيت المعدني الخفيف المرحلة العضوية، في حين يستخدم حامض الخليك لتحميض المستحلب وإطلاق الهلام الداخلي. ومع ذلك، نوع الجينات وتكوينها، فضلا عن المخزن المؤقت عملية اختيار تعتمد على التطبيق المطلوب ³² . وقد استخدمت مجموعة متنوعة من أنواع الجينات (انظر الجدول من المواد) لإنتاج الخرز مع هذا البروتوكول.

Protocol

1. تحضير محلول الألجينات، تعليق الكاكو 3 والنفط الحامض إعداد العازلة العملية والمتوسطة. إعداد العازلة عملية نموذجية تستخدم لتوليد عالية التركيز الخرز ا?…

Representative Results

في نهاية عملية الاستحلاب والهلام الداخلي، يجب استرداد حجم حبة مشابه لحجم الخليط الأولي وخليط الخلية. يجب أن تكون الخرز كروية للغاية مع عدد قليل من العيوب ( الشكل 3 ). يجب أن تكون الخرز قوية بما فيه الكفاية لتحمل بيبتينغ من خلال ماصا…

Discussion

خطوات مختلفة (المبين في الشكل 2 ) خلال رد فعل الهلام الداخلي يمكن أن تحد من حركية الشاملة. بالنسبة للحبوب كربونات الكالسيوم أكبر من ~ 2.5 ميكرون، وقد تبين أن معدل حل كربونات أن الحد من معدل ²⁶ ^، ⁴⁴ . خطوة التحمض التي تؤدي إلى الإفراج ?…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نشكر جيل أوزبورن لعملها الأرض وضع على عملية الاستحلاب ولورين ويلكينسون للحصول على الدعم التقني. نشكر الدكتور إيغور لاسيك، الدكتور تيموثي J. كيفر والدكتور جيمس د. جونسون لإسهاماتهم وتعاونهم. نشكر ديابيت كيبيك، جدرف، ثيسيل، ومركز كوبيكويس سور ليس ماتيريوكس فونكتيونلز (سكمف)، ومجلس العلوم الطبيعية والهندسة البحوث (نزيرك)، ومركز زرع جزيرة الإنسان وتجديد خلايا بيتا، وشبكة الخلايا الجذعية الكندية، و ومؤسسة مايكل سميث للبحوث الصحية، ومؤسسة فوندز كيبيكواز دي لا ريشيرتش سور لا ناتشر إت ليس تيشنولوجيز، و كوست 865 للحصول على الدعم المالي.

Materials

Reagents and consumables
LVM alginate (transplantation-grade)	Novamatrix	Non-applicable	Referred to as "alginate #1" in the results.
MVG alginate (transplantation-grade)	Novamatrix	Non-applicable	Referred to as "alginate #2" in the results.
Alginate (cell culture-grade)	Sigma	A0682 (low viscosity) or A2033 (medium viscosity)	A2033 is referred to as "alginate #3" in the results.
DMEM	Life Technologies	11995-065
Fetal bovine serum, characterized, Canadian origin	Thermo Fisher Scientific	SH3039603
Glutamine	Life Technologies	25030
Penicillin and streptomycin	Sigma	P4333-100ML
HEPES, cell culture tested	Sigma	H4034-100G
NaCl	Thermo Fisher Scientific	S271-1
Fine-grain CaCO₃	Avantor Materials	1301-01	After preparing the CaCO₃ suspension, sonicate and use within one month.
Light mineral oil	Thermo Fisher Scientific	O121-4	Sterile filter through a 0.22 μm pore size membrane prior to use.
Glacial acetic acid	Thermo Fisher Scientific	A38-500	Handle with caution: refer to MSDS.
Sterile spatulas	Sigma	CLS3004-100EA
Sterile nylon cell strainers, 40 µm	Thermo Fisher Scientific	08-771-1
Serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL)	Sarstedt	86.1252.001, 86.1253.001, 86.1254.001 and 86.1685.001
Pasteur pipettes	VWR	14673-043
Toluidine Blue-O	Sigma	T3260
Equipment
100 mL microcarrier spinner flasks	Bellco	1965-00100	The impeller configuration with recent models may not be suitable for adequate emulsification. A blade able to sweep the oil down to 0.5 cm from the bottom of the flask can be custom-made from a Teflon sheet.
Magnetic stir plate with adjustable speed	Bellco	7760-06005	The rotation speed should be calibrated (e.g. using a tachometer) prior to use.
Cell counter	Innovatis	Cedex AS20	This system is now sold by Roche. This automated cell counter can also be replaced by manual cell enumeration after Trypan blue staining using a hemocytometer.
LED light box	Artograph	LightPad® PRO	This item can be replaced by other types of illuminators.
Handheld camera	Canon	PowerShot A590 IS	A variety of handheld cameras can be used to capture toluidine blue-o stained bead images. A ruler should be placed next to the Petri dish containing the beads prior to acquiring images.
Fluorescence microscope with phase contrast and adequate fluorescence filters	Olympus	IX81	Several microscopy systems were used to image the beads. The results shown here were obtained with an IX81 microscope equipped with GFP and TRITC fluorescence filters. To capture entire beads, 4X to 20X objectives were used depending on the agitation rate. Live/dead staining images were typically captured with 20X to 40X objectives.
Image aquisition software	Molecular Devices	Metamorph	A variety of image acquisition software can be used to acquire phase contrast and fluorescence images.
Image analysis freeware	CellProfiler	Non-applicable	A variety of image analysis software can be used to identify beads as objects and analyze bead size (e.g. ImageJ).

Riferimenti

Scharp, D. W., Marchetti, P. Encapsulated islets for diabetes therapy: history, current progress, and critical issues requiring solution. Adv Drug Deliv Rev. 67-68, 35-73 (2014).
Chayosumrit, M., Tuch, B., Sidhu, K. Alginate microcapsule for propagation and directed differentiation of hESCs to definitive endoderm. Biomaterials. 31 (3), 505-514 (2010).
Sidhu, K., Kim, J., Chayosumrit, M., Dean, S., Sachdev, P. Alginate microcapsule as a 3D platform for propagation and differentiation of human embryonic stem cells (hESC) to different lineages. J Vis Exp. (61), (2012).
Tostoes, R. M., et al. Perfusion of 3D encapsulated hepatocytes–a synergistic effect enhancing long-term functionality in bioreactors. Biotechnol Bioeng. 108 (1), 41-49 (2011).
Duvivier-Kali, V. F., Omer, A., Parent, R. J., O’Neil, J. J., Weir, G. C. Complete protection of islets against allorejection and autoimmunity by a simple barium-alginate membrane. Diabetes. 50 (8), 1698-1705 (2001).
Omer, A., et al. Long-term normoglycemia in rats receiving transplants with encapsulated islets. Transplantation. 79 (1), 52-58 (2005).
Rayat, G. R., Rajotte, R. V., Ao, Z., Korbutt, G. S. Microencapsulation of neonatal porcine islets: protection from human antibody/complement-mediated cytolysis in vitro and long-term reversal of diabetes in nude mice. Transplantation. 69 (6), 1084-1090 (2000).
Korbutt, G. S., Mallett, A. G., Ao, Z., Flashner, M., Rajotte, R. V. Improved survival of microencapsulated islets during in vitro culture and enhanced metabolic function following transplantation. Diabetologia. 47 (10), 1810-1818 (2004).
Luca, G., et al. Improved function of rat islets upon co-microencapsulation with Sertoli’s cells in alginate/poly-L-ornithine. AAPS PharmSciTech. 2 (3), E15 (2001).
Omer, A., et al. Survival and maturation of microencapsulated porcine neonatal pancreatic cell clusters transplanted into immunocompetent diabetic mice. Diabetes. 52 (1), 69-75 (2003).
Schneider, S., et al. Long-term graft function of adult rat and human islets encapsulated in novel alginate-based microcapsules after transplantation in immunocompetent diabetic mice. Diabetes. 54 (3), 687-693 (2005).
Cui, H., et al. Long-term metabolic control of autoimmune diabetes in spontaneously diabetic nonobese diabetic mice by nonvascularized microencapsulated adult porcine islets. Transplantation. 88 (2), 160-169 (2009).
Krishnan, R., Alexander, M., Robles, L., Foster, C. E., Lakey, J. R. Islet and stem cell encapsulation for clinical transplantation. Rev Diabet Stud. 11 (1), 84-101 (2014).
Robles, L., Storrs, R., Lamb, M., Alexander, M., Lakey, J. R. Current status of islet encapsulation. Cell Transplant. 23 (11), 1321-1348 (2014).
Desai, T., Shea, L. D. Advances in islet encapsulation technologies. Nat Rev Drug Discov. , (2016).
Anilkumar, A. V., Lacik, I., Wang, T. G. A novel reactor for making uniform capsules. Biotechnol Bioeng. 75 (5), 581-589 (2001).
Wolters, G. H., Fritschy, W. M., Gerrits, D., van Schilfgaarde, R. A versatile alginate droplet generator applicable for microencapsulation of pancreatic islets. J Appl Biomater. 3 (4), 281-286 (1991).
Heinzen, C., Marison, I., Berger, A., von Stockar, U. Use of vibration technology for jet break-up for encapsulation of cells, microbes and liquids in monodisperse microcapsules. Practical Aspects of Encapsulation Technologies. , 19-25 (2002).
Poncelet, D., et al. A Parallel plate electrostatic droplet generator: Parameters affecting microbead size. Applied Microbiology and Biotechnology. 42 (2-3), 251-255 (1994).
Prüße, U., Dalluhn, J., Breford, J., Vorlop, K. D. Production of Spherical Beads by JetCutting. Chemical Engineering & Technology. 23 (12), 1105-1110 (2000).
Hoesli, C. A. . Bioprocess development for the cell-based treatment of diabetes (PhD thesis). , (2010).
Brandenberger, H., Widmer, F. A new multinozzle encapsulation/immobilisation system to produce uniform beads of alginate. J Biotechnol. 63 (1), 73-80 (1998).
Merani, S., Toso, C., Emamaullee, J., Shapiro, A. M. Optimal implantation site for pancreatic islet transplantation. Br J Surg. 95 (12), 1449-1461 (2008).
Reis, C. P., Neufeld, R. J., Vilela, S., Ribeiro, A. J., Veiga, F. Review and current status of emulsion/dispersion technology using an internal gelation process for the design of alginate particles. J Microencapsul. 23 (3), 245-257 (2006).
Poncelet, D., et al. Production of alginate beads by emulsification/internal gelation. I. Methodology. Appl Microbiol Biotechnol. 38 (1), 39-45 (1992).
Poncelet, D., et al. Production of alginate beads by emulsification/internal gelation. II. Physicochemistry. Applied Microbiology and Biotechnology. 43 (4), 644-650 (1995).
Alexakis, T., et al. Microencapsulation of DNA within alginate microspheres and crosslinked chitosan membranes for in vivo application. Appl Biochem Biotechnol. 50 (1), 93-106 (1995).
Vandenberg, G. W., De La Noue, J. Evaluation of protein release from chitosan-alginate microcapsules produced using external or internal gelation. J Microencapsul. 18 (4), 433-441 (2001).
Silva, C. M., Ribeiro, A. J., Figueiredo, I. V., Goncalves, A. R., Veiga, F. Alginate microspheres prepared by internal gelation: development and effect on insulin stability. Int J Pharm. 311 (1-2), 1-10 (2006).
Larisch, B. C., Poncelet, D., Champagne, C. P., Neufeld, R. J. Microencapsulation of Lactococcus lactis subsp. cremoris. J Microencapsul. 11 (2), 189-195 (1994).
Hoesli, C. A., et al. Reversal of diabetes by betaTC3 cells encapsulated in alginate beads generated by emulsion and internal gelation. J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 100 (4), 1017-1028 (2012).
Hoesli, C. A., et al. Pancreatic cell immobilization in alginate beads produced by emulsion and internal gelation. Biotechnol Bioeng. 108 (2), 424-434 (2011).
Reinsel, M. A., Borkowski, J. J., Sears, J. T. Partition Coefficients for Acetic, Propionic, and Butyric Acids in a Crude Oil/Water System. Journal of Chemical & Engineering Data. 39 (3), 513-516 (1994).
Xiu-Dong, L., Wei-Ting, Y., Jun-Zhang, L., Xiao-Jun, M., Quan, Y. Diffusion of acetic acid across oil/water interface in emulsification-internal gelation process for preparation of alginate gel beads. Chemical Research in Chinese Universities. 23 (5), 579-584 (2007).
Fernandez, S. A., et al. Emulsion-based islet encapsulation: predicting and overcoming islet hypoxia. Bioencapsulation Innovations. (220), 14-15 (2014).
Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), R100 (2006).
Hinze, J. O. Fundamentals of the hydrodynamic mechanism of splitting in dispersion processes. AIChE Journal. 1 (3), 289-295 (1955).
Kolmogorov, A. N. On the breakage of drops in a turbulent flow (translated from Russian). Doklady Akademii Nauk. 66, 825-828 (1949).
Davies, J. T. Drop Sizes of Emulsions Related to Turbulent Energy-Dissipation Rates. Chemical Engineering Science. 40 (5), 839-842 (1985).
Pacek, A. W., Chamsart, S., Nienow, A. W., Bakker, A. The influence of impeller type on mean drop size and drop size distribution in an agitated vessel. Chemical Engineering Science. 54 (19), 4211-4222 (1999).
Steiner, H., et al. Numerical simulation and experimental study of emulsification in a narrow-gap homogenizer. Chemical Engineering Science. 61 (17), 5841-5855 (2006).
Tcholakova, S., Denkov, N. D., Lips, A. Comparison of solid particles, globular proteins and surfactants as emulsifiers. Phys Chem Chem Phys. 10 (12), 1608-1627 (2008).
Lagisetty, J. S., Das, P. K., Kumar, R., Gandhi, K. S. Breakage of viscous and non-Newtonian drops in stirred dispersions. Chemical Engineering Science. 41 (1), 65-72 (1986).
Draget, K. I., Ostgaard, K., Smidsrod, O. Homogeneous Alginate Gels – a Technical Approach. Carbohydrate Polymers. 14 (2), 159-178 (1990).
Poncelet, D., Dulieu, C., Jacquot, M., Wijffels, R. H. . Immobilized Cells. , 15-30 (2001).
Islam, A. W., Zavvadi, A., Kabadi, V. N. Analysis of Partition Coefficients of Ternary Liquid-Liquid Equilibrium Systems and Finding Consistency Using Uniquac Model. Chemical and Process Engineering-Inzynieria Chemiczna I Procesowa. 33 (2), 243-253 (2012).
Quong, D., Neufeld, R. J., Skjak-Braek, G., Poncelet, D. External versus internal source of calcium during the gelation of alginate beads for DNA encapsulation. Biotechnol Bioeng. 57 (4), 438-446 (1998).
De Vos, P., De Haan, B. J., Van Schilfgaarde, R. Upscaling the production of microencapsulated pancreatic islets. Biomaterials. 18 (16), 1085-1090 (1997).
Gross, J. D., Constantinidis, I., Sambanis, A. Modeling of encapsulated cell systems. J Theor Biol. 244 (3), 500-510 (2007).

Play Video

PDF

DOI

DOWNLOAD MATERIALS LIST

Citazione di questo articolo

Hoesli, C. A., Kiang, R. L. J., Raghuram, K., Pedroza, R. G., Markwick, K. E., Colantuoni, A. M. R., Piret, J. M. Mammalian Cell Encapsulation in Alginate Beads Using a Simple Stirred Vessel. J. Vis. Exp. (124), e55280, doi:10.3791/55280 (2017).