Mammalian Cell Encapsulation in Alginate Beads Using a Simple Stirred Vessel

Corinne A. Hoesli; Roger L. J. Kiang; Kamini Raghuram; Ren&#233; G. Pedroza; Karen E. Markwick; Antonio M. R. Colantuoni; James M. Piret

doi:10.3791/55280

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Bioingegneria

Encapsulación de células de mamífero en perlas de alginato usando un recipiente agitador simple

Published: June 29, 2017

doi:

10.3791/55280

Corinne A. Hoesli, Roger L. J. Kiang, Kamini Raghuram, René G. Pedroza, Karen E. Markwick, Antonio M. R. Colantuoni, James M. Piret

¹Department of Chemical Engineering,McGill University, ²Michael Smith Laboratories & Department of Chemical and Biological Engineering,University of British Columbia, ³Michael Smith Laboratories & Department of Pharmaceutical Sciences,University of British Columbia

Summary

Este video y el manuscrito describen un método basado en emulsión para encapsular células de mamífero en perlas de alginato al 0,5% al 10% que se pueden producir en grandes lotes usando un simple recipiente agitado. Las células encapsuladas pueden cultivarse in vitro o trasplantarse para aplicaciones de terapia celular.

Abstract

La encapsulación celular en perlas de alginato se ha utilizado para cultivo celular inmovilizado in vitro así como para inmunoisolación in vivo . La encapsulación de islotes pancreáticos se ha estudiado extensamente como un medio para aumentar la supervivencia de los islotes en trasplantes alogénicos o xenogénicos. La encapsulación de alginato se alcanza comúnmente por extrusión de boquillas y gelificación externa. Usando este método, las gotitas de alginato que contienen células formadas en la punta de las boquillas caen en una solución que contiene cationes divalentes que causan gelación ionotrópica de alginato a medida que difunden en las gotitas. El requisito para la formación de gotitas en la punta de la boquilla limita el rendimiento volumétrico y la concentración de alginato que se pueden conseguir. Este video describe un método de emulsificación escalable para encapsular células de mamífero en alginato al 0,5% al 10% con una supervivencia celular del 70% al 90%. Mediante este método alternativo, las gotitas de alginato que contienen células y carbonato de calcio se emulsionan en aceite mineral, folPor una disminución del pH que conduce a la liberación interna de calcio ya la gelificación de alginato ionotrópico. El método actual permite la producción de perlas de alginato dentro de los 20 minutos de la emulsificación. El equipo requerido para la etapa de encapsulación consiste en recipientes agitados simples disponibles para la mayoría de los laboratorios.

Introduction

La encapsulación de células de mamífero se ha estudiado ampliamente como medio para proteger las células trasplantadas del rechazo inmune ¹ o para proporcionar un soporte tridimensional para el cultivo celular inmovilizado ² ^, ³ ^, ⁴ . El encapsulado de islotes pancreáticos en perlas de alginato se ha utilizado para revertir la diabetes en roedores alogénicos ⁵ ^, ⁶ o xenogénicos ⁷ ^, ⁸ ^, ⁹ ^, ¹⁰ ^, ¹¹ ^, ¹² . Los ensayos clínicos y preclínicos del trasplante de islotes pancreáticos encapsulados para tratar la diabetes tipo 1 están en curso ¹³ ^, ¹⁴ ^, ¹⁵ . Para aplicaciones de trasplante o de mayor escalaE la producción de células inmovilizadas in vitro , generalmente se utilizan generadores de perlas basados en boquillas. Típicamente, se bombea una mezcla de alginato y células a través de una boquilla para formar gotitas que caen en una solución agitada que contiene cationes divalentes, dando como resultado la gelificación externa de las gotitas. El flujo de gas coaxial ¹⁶ ^, ¹⁷ , la vibración de boquilla ¹⁸ , la repulsión electrostática ¹⁹ o los hilos giratorios ²⁰ facilitan la formación de gotitas en la punta de la boquilla.

Los inconvenientes principales de los generadores de talón convencionales son su capacidad de producción limitada y el intervalo limitado de viscosidades en solución que darán lugar a una formación adecuada de talones ²¹ . A caudales elevados, el fluido que sale de la boquilla se rompe en gotitas más pequeñas que el diámetro de la boquilla, disminuyendo el control del tamaño. Se pueden utilizar generadores de bolas de boquillas múltiples para aumentar el rendimiento, peroLa distribución uniforme del flujo entre las toberas y el uso de soluciones> 0,2 Pas es problemático ²² . Por último, se espera que todos los dispositivos basados en boquillas impongan algún daño a los islotes, ya que el diámetro de las boquillas utilizadas está entre 100 μm y 500 μm, mientras que el ~ 15% de los islotes humanos puede ser mayor de 200 μm ²³ .

En este video, describimos un método alternativo para encapsular células de mamífero formando gotitas en una única etapa de emulsificación en lugar de gota a gota. Dado que la producción de perlas se realiza en un recipiente de agitación simple, el método es adecuado para una producción pequeña (~ 1 ml) a gran escala (10 ³ L) con costes de equipo reducidos ²⁴ . Este método permite la producción de perlas con alta esfericidad usando una amplia gama de viscosidades de alginato con tiempos de generación cortos ( por ejemplo, 20 min). Este método fue desarrollado originalmente por Poncelet et aL ²⁵ ^, ²⁶ y se usan para inmovilizar el ADN ²⁷ , las proteínas ²⁸ incluyendo la insulina ²⁹ y las bacterias ³⁰ . Recientemente hemos adaptado estos métodos a la encapsulación de células de mamíferos utilizando líneas de células beta pancreáticas ³¹ ^, ³² y tejido pancreático primario ³² .

El principio del método es generar una emulsión agua-en-aceite que consiste en gotitas de alginato en aceite mineral, seguida de gelificación interna de las gotitas de alginato ( Figura 1 ). En primer lugar, el encapsulante ( por ejemplo, células) se dispersa en una solución de alginato que contiene una sal de calcio de grano fino con baja solubilidad al pH del proceso inicial. A continuación se añade la mezcla de alginato a una fase orgánica agitada para crear una emulsión, usualmente en presencia de unTensioactivo. En el caso de la encapsulación de células de mamífero, los componentes presentes en el suero pueden actuar como tensioactivos. A continuación, se reduce el pH con el fin de solubilizar la sal de calcio añadiendo un ácido soluble en aceite que divide en la fase acuosa. El ácido acético, con un coeficiente de reparto de aceite mineral / agua <0,005 ³³ , debe ser pre-disuelto en aceite, luego se agrega a la emulsión donde se mezcla en la fase oleosa y se divide rápidamente en la fase acuosa ³⁴ . La Figura 2 ilustra las reacciones químicas y la difusión que tienen lugar durante la etapa de acidificación y gelificación interna. Finalmente, las células encapsuladas se recuperan mediante inversión de fase, separación de fases acelerada por centrifugación, etapas de lavado repetidas y filtración. Estos pasos pueden ser seguidos por muestreo de cuentas y células para análisis de control de calidad, cultivo celular in vitro y / o transplante de las células encapsuladas.

Figura 1: Esquema del proceso basado en emulsificación para encapsular células de mamífero. Las perlas se producen primero emulsionando un alginato, una célula y _una mezcla de CaCO3 en aceite mineral (pasos 1 y 2 en el esquema), desencadenando la gelificación interna añadiendo ácido acético (paso 3). Las perlas gelificadas se separan después del aceite mediante la adición de un tampón acuoso para activar la inversión de fase (etapa 4), seguido de centrifugación y aspiración de aceite (etapa 5), y después filtración (etapa 6). Finalmente, las perlas recogidas en el filtro se transfieren al medio de cultivo celular para cultivo in vitro o para trasplante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Reacciones y etapas de difusión que ocurren durante la gelificación interna. (1) Se añade ácido acético a la fase orgánica y se transporta a las gotitas de alginato por convección. (2) El ácido acético se divide en la fase acuosa. (3) En presencia de agua, el ácido se disocia y difunde hasta alcanzar los granos de CaCO3 representados en azul oscuro. (4) Los iones H ⁺ se intercambian con los iones Ca ²⁺ en CaCO ₃ , liberando iones Ca ²⁺ . (5) Los iones de calcio se difunden hasta que encuentran alginato sin reaccionar, dando lugar a la reticulación ionotrópica de las cadenas de alginato. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Contrariamente a los encapsuladores convencionales de celdas basadas en boquillas, una amplia distribución de tamaño de cordón es expeCitado a partir de este proceso debido al mecanismo de formación de gotitas en emulsificación agitada. Para un subconjunto de aplicaciones, esta distribución de tamaño de talón puede ser problemática. Por ejemplo, una fracción mayor de células puede estar expuesta en la superficie del cordón en perlas más pequeñas. Si las limitaciones de nutrientes ( por ejemplo, oxígeno) son una preocupación, estas limitaciones pueden exacerbarse en cuentas más grandes. Una ventaja del método de emulsión agitado es que el tamaño medio del cordón se puede ajustar fácilmente cambiando la velocidad de agitación durante la etapa de emulsión. La amplia distribución del tamaño del cordón también puede explotarse para estudiar el efecto del tamaño del cordón sobre el rendimiento de las células encapsuladas.

La encapsulación de las células de los mamíferos por emulsificación y gelificación interna es una alternativa interesante para los laboratorios que no están equipados con un generador de bolas. Además, este método ofrece a los usuarios la opción de reducir el tiempo de procesamiento, o generar perlas a muy bajo o muy alto concentrado de alginatoAciones.

El protocolo descrito a continuación describe cómo encapsular células en 10,5 ml de solución de alginato al 5% preparada en tampón de ácido 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinoetanosulfónico (HEPES) 10 mM. El alginato consiste en una mezcla 50:50 de LVM de grado de trasplante (contenido de ácido manurónico alto en baja viscosidad) y alginato MVG (contenido de ácido gulurónico alto contenido en viscosidad media). Se utiliza carbonato de calcio a una concentración final de 24 mM como agente reticulante físico. El aceite mineral ligero constituye la fase orgánica, mientras que el ácido acético se utiliza para acidificar la emulsión y desencadenar la gelificación interna. Sin embargo, el tipo y composición de alginato, así como el tampón de proceso seleccionado dependen de la aplicación deseada ³² . Se ha utilizado una variedad de tipos de alginato (véase Tabla de materiales) para producir perlas con este protocolo.

Protocol

1. Preparar la Solución de Alginato, la Suspensión de CaCO3 y el Aceite Acidificado Prepare el buffer de proceso y el medio. Prepare el tampón de proceso típico usado para generar perlas de alginato de alta concentración utilizando HEPES 10 mM, NaCl 170 mM. Ajuste el pH a 7.4. Preparar el medio de cultivo típico usando Medio de Eagle Modificado de Dulbecco (DMEM) que contiene suero bovino fetal al 10% (FBS), glutamina 6 mM, penicilina 100 U / mL y estreptomicina 100 m…

Representative Results

Al final del proceso de emulsificación y gelificación interna, se debe recuperar un volumen de perlas similar al del alginato inicial y al volumen de la mezcla celular. Las cuentas deben ser muy esféricas con pocos defectos ( Figura 3 ). Las perlas deben ser suficientemente fuertes para soportar la pipeteado a través de pipetas de gran calibre. A altas concentraciones de alginato, se pueden observar gotas de aceite o aire encapsuladas en las perlas…

Discussion

Varias etapas (representadas en la Figura 2 ) durante la reacción de gelificación interna pueden limitar la cinética global. Para los granos de carbonato cálcico mayores de ~ 2,5 μm, se ha demostrado que la velocidad de disolución del carbonato es limitante ^{de la} velocidad ²⁶ ^, ⁴⁴ . La etapa de acidificación que conduce a la liberación interna de calcio también ha demostrado ser la variable crítica del proceso q…

Divulgazioni

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Damos las gracias a Jill Osborne por su trabajo de puesta a tierra en el proceso de emulsificación y Lauren Wilkinson para el apoyo técnico. Agradecemos al Dr. Igor Laçik, al Dr. Timothy J. Kieffer y al Dr. James D. Johnson por su contribución y colaboración. Agradecemos a Diabète Québec, a la JDRF, a ThéCell, al Centro de Investigación en Ciencias Naturales e Ingeniería (CRSNG), al Centro para el Trasplante de Islotes Humanos y la Regeneración de Células Beta, la Red Canadiense de Células Madre, Fundación Michael Smith para la Investigación en Salud, el Fondo québécois de la investigación sobre la naturaleza y las tecnologías y COST 865 para apoyo financiero.

Materials

Reagents and consumables
LVM alginate (transplantation-grade)	Novamatrix	Non-applicable	Referred to as "alginate #1" in the results.
MVG alginate (transplantation-grade)	Novamatrix	Non-applicable	Referred to as "alginate #2" in the results.
Alginate (cell culture-grade)	Sigma	A0682 (low viscosity) or A2033 (medium viscosity)	A2033 is referred to as "alginate #3" in the results.
DMEM	Life Technologies	11995-065
Fetal bovine serum, characterized, Canadian origin	Thermo Fisher Scientific	SH3039603
Glutamine	Life Technologies	25030
Penicillin and streptomycin	Sigma	P4333-100ML
HEPES, cell culture tested	Sigma	H4034-100G
NaCl	Thermo Fisher Scientific	S271-1
Fine-grain CaCO₃	Avantor Materials	1301-01	After preparing the CaCO₃ suspension, sonicate and use within one month.
Light mineral oil	Thermo Fisher Scientific	O121-4	Sterile filter through a 0.22 μm pore size membrane prior to use.
Glacial acetic acid	Thermo Fisher Scientific	A38-500	Handle with caution: refer to MSDS.
Sterile spatulas	Sigma	CLS3004-100EA
Sterile nylon cell strainers, 40 µm	Thermo Fisher Scientific	08-771-1
Serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL)	Sarstedt	86.1252.001, 86.1253.001, 86.1254.001 and 86.1685.001
Pasteur pipettes	VWR	14673-043
Toluidine Blue-O	Sigma	T3260
Equipment
100 mL microcarrier spinner flasks	Bellco	1965-00100	The impeller configuration with recent models may not be suitable for adequate emulsification. A blade able to sweep the oil down to 0.5 cm from the bottom of the flask can be custom-made from a Teflon sheet.
Magnetic stir plate with adjustable speed	Bellco	7760-06005	The rotation speed should be calibrated (e.g. using a tachometer) prior to use.
Cell counter	Innovatis	Cedex AS20	This system is now sold by Roche. This automated cell counter can also be replaced by manual cell enumeration after Trypan blue staining using a hemocytometer.
LED light box	Artograph	LightPad® PRO	This item can be replaced by other types of illuminators.
Handheld camera	Canon	PowerShot A590 IS	A variety of handheld cameras can be used to capture toluidine blue-o stained bead images. A ruler should be placed next to the Petri dish containing the beads prior to acquiring images.
Fluorescence microscope with phase contrast and adequate fluorescence filters	Olympus	IX81	Several microscopy systems were used to image the beads. The results shown here were obtained with an IX81 microscope equipped with GFP and TRITC fluorescence filters. To capture entire beads, 4X to 20X objectives were used depending on the agitation rate. Live/dead staining images were typically captured with 20X to 40X objectives.
Image aquisition software	Molecular Devices	Metamorph	A variety of image acquisition software can be used to acquire phase contrast and fluorescence images.
Image analysis freeware	CellProfiler	Non-applicable	A variety of image analysis software can be used to identify beads as objects and analyze bead size (e.g. ImageJ).

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Hoesli, C. A., Kiang, R. L. J., Raghuram, K., Pedroza, R. G., Markwick, K. E., Colantuoni, A. M. R., Piret, J. M. Mammalian Cell Encapsulation in Alginate Beads Using a Simple Stirred Vessel. J. Vis. Exp. (124), e55280, doi:10.3791/55280 (2017).