Säugetierzellverkapselung in Alginatperlen unter Verwendung eines einfachen gerafften Gefäßes

Summary

Dieses Video und Manuskript beschreiben ein Emulsions-basiertes Verfahren zur Einkapselung von Säugetierzellen in 0,5% bis 10% Alginatperlen, die in großen Chargen unter Verwendung eines einfachen Rührkessels hergestellt werden können. Die eingekapselten Zellen können in vitro kultiviert oder für zelluläre Therapieanwendungen transplantiert werden.

Abstract

Die Zellverkapselung di Alginatperlen wurde für die immobilisierte Zellkultur in vitro sowie für die Immunisolierung in vivo verwendet . Die Pankreasinselverkapselung wurde weitgehend als Mittel zur Erhöhung des Überfalles der Insel in allogenen oder xenogenen Transplantaten untersucht. Die Alginatverkapselung wird üblicherweise durch Düsenextrusion und externe Gelierung erreicht. Unter Verwendung dieses Verfahrens fallen zellhaltige Alginat-Tröpfchen, die an der Spitze der Düsen gebildet werden, in eine Lösung, die zweiwertige Kationen enthält, die eine ionotrope Alginat-Gelierung verursachen, wenn sie in die Tröpfchen diffundieren. Die Forderung nach Tröpfchenbildung an der Düsenspitze begrenzt den volumetrischen Durchsatz und die Alginatkonzentration, die erreicht werden kann. Dieses Video beschreibt ein skalierbares Emulgierungsverfahren zum Einkapseln von Säugetierzellen in 0,5% bis 10% Alginat mit 70% bis 90% Zellüberleben. Durch dieses alternative Verfahren werden Alginat-Tröpfchen, die Zellen und Calciumcarbonat enthalten, in Mineralöl emulgiertDurch eine Abnahme des pH-Werts, die zu einer internen Calciumfreisetzung und einer ionotropen Alginat-Gelierung führt, Die aktuelle Methode ermöglicht die Herstellung von Alginatperlen innerhalb von 20 min Emulgierung. Die für den Einkapselungsschritt benötigte Ausrüstung besteht in einfachen Rührgefäßen, die für die meisten Laboratorien zur Verfügung stehen.

Introduction

Die Säugerzellverkapselung wurde weitgehend als Mittel zum Schutz transplantierter Zellen aus der Immunabstoßung ¹ oder zur Bereitstellung eines dreidimensionalen Trägers für die immobilisierte Zellkultur ^{2 , 3 , 4 untersucht} . Eine Pankreasinselverkapselung in Alginatperlen wurde verwendet, um Diabetes in allogenen ^{5 , 6} oder xenogenen ^{7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12} Nagetieren umzukehren. Präklinische und klinische Studien der eingekapselten Pankreasinsel-Transplantation zur Behandlung von Typ-1-Diabetes sind im Gange ^{13 , 14 , 15} . Für Transplantationsanwendungen oder größeres SkalierenE in vitro immobilisierte Zellproduktion, Düsen-basierte Wulstgeneratoren werden im allgemeinen verwendet. Typischerweise wird ein Gemisch aus Alginat und Zellen durch eine Düse gepumpt, um Tröpfchen zu bilden, die in eine gerührte Lösung fallen, die zweiwertige Kationen enthält, was zu einer externen Gelierung der Tröpfchen führt. Der koaxiale Gasfluss ^{16 , 17} , die Düsenvibration ¹⁸ , die elektrostatische Abstoßung ¹⁹ oder die rotierenden Drähte ²⁰ erleichtern die Tröpfchenbildung an der Düsenspitze.

Die Hauptnachteile herkömmlicher Wulstgeneratoren sind ihr begrenzter Durchsatz und der begrenzte Bereich der Lösungsviskositäten, der zu einer adäquaten Wulstbildung führen wird. Bei hohen Strömungsraten zerfällt das aus der Düse austretende Fluid in Tröpfchen, die kleiner sind als der Düsendurchmesser, wodurch die Größensteuerung verringert wird. Multi-Düse Wulstgeneratoren können verwendet werden, um den Durchsatz zu erhöhen, aberDie gleichmäßige Verteilung der Strömung zwischen den Düsen und die Verwendung von Lösungen> 0,2 Pas ist problematisch ²² . Schließlich wird erwartet, dass alle Düsen-basierten Vorrichtungen den Inselchen einen gewissen Schaden zufügen, da der Durchmesser der verwendeten Düsen zwischen 100 μm und 500 μm beträgt, während ~ 15% der menschlichen Inseln größer als 200 μm ^{23 sein können} .

In diesem Video beschreiben wir ein alternatives Verfahren zur Einkapselung von Säugetierzellen durch Bildung von Tröpfchen in einem einzigen Emulgierungsschritt anstelle von Tropfen-zu-Tropfen. Da die Wulstproduktion in einem einfachen Rührkessel durchgeführt wird, eignet sich das Verfahren für kleine (~ 1 mL) bis großformatige (10 ³ L) Perlenproduktion mit geringen Ausrüstungskosten ²⁴ . Diese Methode ermöglicht die Herstellung von Perlen mit hoher Sphärizität unter Verwendung eines breiten Bereichs von Alginat-Viskositäten mit kurzen ( z. B. 20 min) Wulst-Erzeugungszeiten. Diese Methode wurde ursprünglich von Poncelet et alL. ^{25 , 26} und verwendet, um DNA ²⁷ , Proteine ²⁸ einschließlich Insulin ²⁹ und Bakterien ³⁰ zu immobilisieren. Wir haben diese Methoden vor kurzem an die Verkapselung von Säugetierzellen angepasst, wobei die pankreatischen Beta-Zelllinien ^{31 , 32} und das primäre Pankreasgewebe ^{32 verwendet wurden} .

Das Prinzip des Verfahrens besteht darin, eine Wasser-in-Öl-Emulsion zu erzeugen, die aus Alginat-Tröpfchen in Mineralöl besteht, gefolgt von einer internen Gelierung der Alginat-Tröpfchen ( Abbildung 1 ). Zuerst wird das Verkapselungsmittel ( z. B. Zellen) in einer Alginatlösung dispergiert, die ein feinkörniges Calciumsalz mit geringer Löslichkeit bei dem anfänglichen pH-Wert enthält. Die Alginatmischung wird dann zu einer gerührten organischen Phase zugegeben, um eine Emulsion zu erzeugen, üblicherweise in Gegenwart von aTensid Im Falle der Säugerzellverkapselung können im Serum vorhandene Komponenten als Tenside wirken. Als nächstes wird der pH-Wert reduziert, um das Calciumsalz durch Zugabe einer öllöslichen Säure, die sich in die wässrige Phase einteilt, zu lösen. Essigsäure mit einem Mineralöl / Wasser-Verteilungskoeffizienten <0,005 ³³ sollte in Öl vorgelöst und dann der Emulsion zugesetzt werden, wo sie in der Ölphase gemischt wird und sich schnell in die wässrige Phase ^{34 einteilt} . Fig. 2 zeigt die chemischen Reaktionen und die Diffusion, die während der Versauerung und des inneren Gelierungsschrittes stattfinden. Schließlich werden die eingekapselten Zellen durch Phaseninversion, Phasentrennung, die durch Zentrifugation, wiederholte Waschschritte und Filtration beschleunigt wird, gewonnen. Auf diese Schritte können dann Perlen- und Zellproben für Qualitätskontrollanalysen, in vitro Zellkultur und / oder Transplantation der eingekapselten Zellen verfolgt werden.

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Abbildung 1: Schematische Darstellung des emulgierungsbasierten Prozesses zur Einkapselung von Säugetierzellen. Perlen werden zuerst durch Emulgieren einer Alginat-, Zell- und CaCO ₃ -Mischung in Mineralöl (Schritte 1 und 2 im Schema) hergestellt, wobei die innere Gelierung durch Zugabe von Essigsäure ausgelöst wird (Schritt 3). Die gelierten Perlen werden dann durch Zugabe eines wässrigen Puffers zur Triggerphaseninversion (Schritt 4) von dem Öl abgetrennt, gefolgt von Zentrifugation und Ölabsaugung (Schritt 5) und dann Filtration (Schritt 6). Schließlich werden die auf dem Filter gesammelten Kügelchen in Zellkulturmedium für in vitro Kultur oder zur Transplantation überführt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

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Abbildung 2: Reaktionen und Diffusionsschritte bei interner Gelierung. (1) Essigsäure wird der organischen Phase zugesetzt und durch Konvektion zu den Alginattropfen transportiert. (2) Die Essigsäure trennt sich in die wässrige Phase. (3) In Gegenwart von Wasser dissoziiert und diffundiert die Säure, um die CaCO ₃ -Körner zu erreichen, die in dunkelblau dargestellt sind. (4) Die H ⁺ -Ionen werden mit Ca ²⁺ -Ionen in CaCO ₃ ausgetauscht, wobei Ca ²⁺ -Ionen freigesetzt werden. (5) Die Calciumionen diffundieren, bis sie auf nicht umgesetztes Alginat stoßen, was zur ionotropen Vernetzung der Alginatketten führt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.

Im Gegensatz zu herkömmlichen Düsen-basierten Zellverkapselungen ist eine breite Wulstgrößenverteilung zu erwartenAus diesem Verfahren aufgrund des Mechanismus der Tröpfchenbildung bei gerührter Emulgierung. Für eine Teilmenge von Anwendungen kann diese Perlengrößenverteilung problematisch sein. Beispielsweise kann ein größerer Anteil an Zellen an der Wulstoberfläche in kleineren Perlen belichtet werden. Wenn Nährstoff ( z. B. Sauerstoff) Einschränkungen ein Anliegen sind, können diese Einschränkungen in größeren Perlen verschärft werden. Ein Vorteil des gerührten Emulgierverfahrens besteht darin, daß die mittlere Wulstgröße leicht durch Ändern der Rührgeschwindigkeit während des Emulgierungsschritts eingestellt werden kann. Die breite Wulstgrößenverteilung kann auch genutzt werden, um die Wirkung der Perlengröße auf die eingekapselte Zellleistung zu untersuchen.

Säugetierzellverkapselung durch Emulgierung und interne Gelierung ist eine interessante Alternative für Laboratorien, die nicht mit einem Wulstgenerator ausgestattet sind. Darüber hinaus bietet diese Methode den Anwendern die Möglichkeit, die Verarbeitungszeit zu reduzieren oder Perlen in sehr niedrigem oder sehr hohem Alginatkonzentrat zu erzeugenAtions

Das nachstehend beschriebene Protokoll beschreibt die Einkapselung von Zellen in 10,5 ml einer 5% igen Alginatlösung, hergestellt in 10 mM 4- (2-Hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsäure (HEPES) -Puffer. Das Alginat besteht aus einer 50: 50-Mischung aus Transplantationsgrad-LVM (niedrigviskoser hoher Mannuronsäuregehalt) und MVG (mittlerer Viskosität hoher Guluronsäuregehalt) Alginat. Calciumcarbonat mit einer Endkonzentration von 24 mM wird als physikalisches Vernetzungsmittel verwendet. Leichtes Mineralöl bildet die organische Phase, während Essigsäure verwendet wird, um die Emulsion zu säuern und interne Gelierung auszulösen. Jedoch hängen der Alginattyp und die Zusammensetzung sowie der ausgewählte Prozesspuffer von der gewünschten Anwendung ^{32 ab} . Eine Vielzahl von Alginattypen (siehe Tabelle der Materialien) wurden verwendet, um Perlen mit diesem Protokoll herzustellen.

Protocol

1. Die Alginatlösung, die CaCO 3 Suspension und das Acidified Oil vorbereiten Vorbereiten des Prozesspuffers und des Mediums. Bereiten Sie den typischen Prozesspuffer vor, der zur Erzeugung von hochkonzentrierten Alginatperlen unter Verwendung von 10 mM HEPES, 170 mM NaCl verwendet wird. Den pH-Wert auf 7,4 einstellen. Bereiten Sie das typische Kulturmedium mit Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 6 mM Glutamin, 100 U /…

Representative Results

Am Ende des Emulgierens und des internen Gelierungsverfahrens sollte ein Perlenvolumen ähnlich dem anfänglichen Alginat- und Zellgemischvolumen gewonnen werden. Die Perlen sollten mit wenigen Defekten sehr sphärisch sein ( Abbildung 3 ). Die Perlen sollten ausreichend stark sein, um Pipettieren durch großporige Pipetten zu widerstehen. Bei hohen Alginatkonzentrationen können eingekapselte Öl- oder Lufttröpfchen in den Kügelchen beobachtet werde…

Discussion

Verschiedene Schritte (dargestellt in Abbildung 2 ) während der internen Gelierungsreaktion können die Gesamtkinetik begrenzen. Für Calciumcarbonatkörner, die grßer als ~ 2,5 um sind, hat sich gezeigt, daß die Rate der Carbonatauflösung eine ratenbegrenzende ^{26 , 44 aufweist} . Der Säuerungsschritt, der zur internen Calciumfreisetzung führt, hat sich auch als die kritische Prozeßvariable erwiesen, die das Zellüberleben beeinflußt <sup…

Materials

Reagents and consumables
LVM alginate (transplantation-grade)	Novamatrix	Non-applicable	Referred to as "alginate #1" in the results.
MVG alginate (transplantation-grade)	Novamatrix	Non-applicable	Referred to as "alginate #2" in the results.
Alginate (cell culture-grade)	Sigma	A0682 (low viscosity) or A2033 (medium viscosity)	A2033 is referred to as "alginate #3" in the results.
DMEM	Life Technologies	11995-065
Fetal bovine serum, characterized, Canadian origin	Thermo Fisher Scientific	SH3039603
Glutamine	Life Technologies	25030
Penicillin and streptomycin	Sigma	P4333-100ML
HEPES, cell culture tested	Sigma	H4034-100G
NaCl	Thermo Fisher Scientific	S271-1
Fine-grain CaCO3	Avantor Materials	1301-01	After preparing the CaCO3 suspension, sonicate and use within one month.
Light mineral oil	Thermo Fisher Scientific	O121-4	Sterile filter through a 0.22 μm pore size membrane prior to use.
Glacial acetic acid	Thermo Fisher Scientific	A38-500	Handle with caution: refer to MSDS.
Sterile spatulas	Sigma	CLS3004-100EA
Sterile nylon cell strainers, 40 µm	Thermo Fisher Scientific	08-771-1
Serological pipettes (2 mL, 5 mL, 10 mL, 25 mL)	Sarstedt	86.1252.001, 86.1253.001, 86.1254.001 and 86.1685.001
Pasteur pipettes	VWR	14673-043
Toluidine Blue-O	Sigma	T3260
Equipment
100 mL microcarrier spinner flasks	Bellco	1965-00100	The impeller configuration with recent models may not be suitable for adequate emulsification. A blade able to sweep the oil down to 0.5 cm from the bottom of the flask can be custom-made from a Teflon sheet.
Magnetic stir plate with adjustable speed	Bellco	7760-06005	The rotation speed should be calibrated (e.g. using a tachometer) prior to use.
Cell counter	Innovatis	Cedex AS20	This system is now sold by Roche. This automated cell counter can also be replaced by manual cell enumeration after Trypan blue staining using a hemocytometer.
LED light box	Artograph	LightPad® PRO	This item can be replaced by other types of illuminators.
Handheld camera	Canon	PowerShot A590 IS	A variety of handheld cameras can be used to capture toluidine blue-o stained bead images. A ruler should be placed next to the Petri dish containing the beads prior to acquiring images.
Fluorescence microscope with phase contrast and adequate fluorescence filters	Olympus	IX81	Several microscopy systems were used to image the beads. The results shown here were obtained with an IX81 microscope equipped with GFP and TRITC fluorescence filters. To capture entire beads, 4X to 20X objectives were used depending on the agitation rate. Live/dead staining images were typically captured with 20X to 40X objectives.
Image aquisition software	Molecular Devices	Metamorph	A variety of image acquisition software can be used to acquire phase contrast and fluorescence images.
Image analysis freeware	CellProfiler	Non-applicable	A variety of image analysis software can be used to identify beads as objects and analyze bead size (e.g. ImageJ).