Fremstilling af Giant vesikler indkapslende mikrosfærer ved centrifugering af en vand-i-olie-emulsion

Summary

Giant vesicles containing highly packed micrometer-sized components are useful cell models. The water-in-oil emulsion centrifugation method is a simple, powerful tool for the preparation of giant vesicles with encapsulated materials.

Abstract

Den konstruktive biologi og syntetisk biologi tilgang til at skabe kunstigt liv indebærer bottom-up samling af biologiske eller ikke-biologiske materialer. Sådanne tilgange har fået betydelig opmærksomhed i forskningen på grænsen mellem levende og ikke levende stof og er blevet brugt til at konstruere kunstige celler i de seneste to årtier. Især har Giant Vesikler (GV'er) ofte blevet anvendt som kunstige cellemembraner. I dette papir, vi beskriver fremstillingen af ​​GV'er indkapsler stærkt pakket mikrokugler som en model af celler indeholdende kondenserede biomolekyler. De GV'er blev fremstillet ved hjælp af en simpel vand-i-olie-emulsion centrifugering metode. Specifikt blev en homogenisator anvendes til at emulgere en vandig opløsning indeholdende de materialer, der skal indkapsles, og en olie indeholdende opløste phospholipider, og den resulterende emulsion blev lagt forsigtigt på overfladen af ​​en anden vandig opløsning. Den lagdelte system blev derefter centrifugeret to generere GV'er. Denne kraftfulde metode blev anvendt til at indkapsle materialer lige fra små molekyler til mikrosfærer.

Introduction

Den konstruktive, eller syntetisk, biologi tilgang er en fascinerende avenue for at udforske grænsen mellem levende og ikke levende stof. Fordi cellen er den mindste, som kræves til liv, som vi i øjeblikket forstår det, forskellige forskere har forsøgt at konstruere kunstige celler fra enkle, godt forståede kemikalier, så fænomener, der opstår inden for sådanne kunstige celler kan studeres, med det ultimative mål at belyse livets oprindelse og studere de grundlæggende funktioner af levende celler ^{1, 2, 3.} Især vesikler ^4, som er sfæriske microcompartments fremstillet af amfifile molekyler og kan indkapsle biologiske molekyler, såsom proteiner ^{5, 6} og DNA ^{7, 8, 9,}lass = "xref"> 10, er ofte blevet brugt som modeller for biologiske membraner.

Vesikler kan klassificeres som små (defineret som har en diameter på <100 nm), stor (diameter <1 um), eller kæmpe (diameter> 1 um). Giant vesikler (GVS) er blevet omfattende undersøgt, fordi de ligner levende celler i størrelse, form og struktur. På grund af størrelsen af ​​GV'er, kan let observeres morfologiske ændringer i GV membraner i realtid under et optisk mikroskop.

Adskillige fremgangsmåder til fremstilling GV'er er blevet rapporteret ^11, herunder hydrering metode ^{12, 13,} fryse-tø-metoden ^14, den electroformation metode ^{15, 16,} og den fluidindretning metode ^{17, 18.} Men indkapsler protein og andre MACROMolecules i GVS ved høje koncentrationer ved hjælp af disse metoder er vanskelig. Navnlig er det ekstremt udfordrende at indkapsle biologiske materialer i en sådan mængde (20-30 vol%) for at efterligne den overfyldt miljø inde celler ^{19, 20.} Til dannelse GV'er øjeblikkeligt, Weitz og medarbejdere etableret en vand-i-olie (v / o) emulsion centrifugering metode ^{21, 22.} Denne metode har fem vigtige funktioner. Først, fordi GV'er fremstillet ved denne fremgangsmåde har lav lamellarity ^{23, 24,} deres membraner er så tynde, at de kan deformeres let. GV membran deformation induceret af FtsZ (en bakteriel celledeling protein), tubulin, og andre makromolekyler er blevet undersøgt ^{25, 26, 27, 28,} og vi observerede polyhe Dron-lignende deformation af GV membraner induceret ved indkapsling af mikrokugler ^{29, 30.} For det andet kan membranproteiner indsættes i vesikulær membran ved denne metode, omend med besvær ^31. For eksempel Yomo gruppe brugt denne metode til at studere in vitro-syntese og poredannende aktivitet af membranproteinet α-hæmolysin ^32. Det tredje er det muligt at generere asymmetriske GV'er hvor lipidbestanddele i de indre og ydre foldere er forskellige ^22. F.eks Whittenton et al. genereret asymmetriske GV'er med kationiske lipider i den indre folder at indkapsle negativt ladede polynucleotider, og med neutrale lipider på den ydre folder for at reducere toksicitet og uspecifik cellulær optagelse ^33. For det fjerde kan koncentrationen og volumen fraktion af stoffer inde i GV'er være relativt højs = "xref"> ^{28, 34.} Femte, kan flere typer af materialer indkapsles ^35. For eksempel, Nishimura et al. indkapslet en in vitro-transskription-translationssystem i GV'er og brugt systemet til at udtrykke grønt fluorescerende protein (GFP) i GV'er ^36. Disse fem funktioner gør v / o-emulsion centrifugering en uundværlig metode til generering af celle-efterlignende GV'er.

I tidligere arbejde blev GV'er genereret ved centrifugering opsamles ved hjælp af en sprøjte udstyret med en lang 16 G kanyle af rustfrit stål indeholdende noget af den endelige vandige opløsning ^22. I hænderne på uerfarne teknikere, kunne denne samling metode let føre til forurening af GV med noget af olien. I denne undersøgelse anvendte vi v / o-emulsion centrifugering protokol udviklet af den Yomo gruppe ^{23, 37,}hvori opsamles udfældede GV'er gennem et hul åbnet i bunden af ​​centrifugeglasset, hvori de er fremstillet. Vi forberedte GV'er indkapsler 1,0 um mikrosfærer, som er på størrelse med intracellulære organeller. Anvendelsen af ​​mikrokugler tilladt os at estimere koncentrationen ved at beregne deres volumenfraktion. Etablering af en metode til fremstilling af GV'er hvor materialer er tæt pakket er et vigtigt skridt for at skabe kunstige celler. For at bekræfte anvendeligheden af ​​vores protokol af forskellige former for indre materialer, vi viste også, at GFP og et lille vandopløseligt fluorescerende molekyle (uranine) kunne indkapsles i GV'er.

Protocol

1. Fremstilling af GV'er af W / O-emulsion Centrifugering Metode Der fremstilles en stamopløsning af 1,2-dioleoyl–sn-glycero-3-phosphocholin (DOPC, 25 mM) og en stamopløsning af Texas Red 1,2-dihexadecanoyl–sn-glycero-3-phosphoethanolamin, triethylammoniumsalt (Texas Red DHPE, 0,20 mM) i chloroform og gemme stamopløsninger ved -20 ° C. Forbered en olie løsning. Danne en lipidfilm på den indvendige overflade af en 5 ml hætteglas ved afdampning af en blanding af DOPC stamopløsning (51,0 pi og Texas Red DHPE stamopløsning (19,2 pi) under strømmende nitrogengas. Inkuber filmen under reduceret tryk natten over og derefter tilføje 1,0 ml flydende paraffin (0,86-0,89 g / cm3) til hætteglasset. Pak hætteglasset i aluminiumsfolie og inkuberes det ved 80 ° CO / N i hvile. De endelige koncentrationer af DOPC og Texas Red DHPE er 1,3 og 3,8 x 10 – 3 mMHenholdsvis og DOPC: Texas Red DHPE molforholdet er 100: 0,3. Forbered den indre vandige dispersion. I en 1,5 ml med låg mikrorør, blandes 237,5 pi af en dispersion af 1,0 um ikke-fluorescerende mikrosfærer (2,5 vol%) og 12,5 pi af en dispersion af 1,0 um fluorescerende mikrosfærer (2,5 vol%); dette svarer til en 95: 5 (v / v) forhold på ikke-fluorescerende til fluorescerende mikrosfærer. Tilføj 64 mg saccharose efterfulgt af 125 pi Tris-bufret opløsning (TBS, 1 M) og 875 pi deioniseret vand. Den endelige fraktion af mikrosfærer volumen er 0,5 vol-%, og de endelige koncentrationer af Tris-HCI (pH 7,5) og saccharose er 0,1 og 0,15 M henholdsvis. Vortex mikrorør i 30 sekunder og derefter lydbehandling det i 10 minutter. Forbered den ydre vandige opløsning. Efter fremstilling af 10 ml af en Tris-bufret opløsning (0,1 M Tris-HCI [pH 7,5], 0,15 M glucOSE) i den samme procedure som indre vandige medier, placere 1 ml af opløsningen i en 1,5 ml låg mikrorør. Vortex mikrorør i 30 sekunder og derefter lydbehandling det i 10 minutter. Forbered w / o-emulsion indeholdende mikrosfærer. Bland 1 ml olie-opløsning (flydende paraffin indeholdende DOPC og Texas Red DHPE) med 300 pi den indre vandige opløsning i en 1,5 ml mikrorør. Emulgere de to komponenter i mikrorør ved anvendelse af en mekanisk homogenisator (en omrører med blade, der roterer ved høj hastighed) drives ved 10.000 rpm i 2 minutter ved stuetemperatur. Udfælde GV'er. Forsigtigt lag 300 pi af v / o-emulsion på oversiden af ​​1 ml af den ydre vandige opløsning ved 4 ° C i en 1,5 ml låg mikrorør. Chill mikrorør i 10 minutter ved 4 ° C. Saml GV'er. Umiddelbart efter nedkøling af mikrorør,centrifugeres det ved 18.000 x g i 30 min. Opnå de udfældede GV'er ved at gennembore bunden af ​​mikrorør med en kortnål og opsamling én dråbe i en steriliseret 1,5 ml mikrorør. Fortyndes udfældet GV dråbe 10-100 gange ved volumen med den ydre vandig opløsning, hvis der opnås de opnåede GV'er i mængder store nok til at gøre observation vanskelig. 2. Mikroskopi Observation af GV'er Forbered mikroskopi eksemplar. Placer en klæbende inkubation kammer til in situ polymerasekædereaktion og hybridisering (kammer størrelse 9 mm x 9 mm x 0,3 mm tyk) oven på et mikroskop dækglas. Med en mikropipette deposit 25 pi fortyndet udfældede GV'er på prøven område og straks placere en anden dækglasset (ca. 0,15 mm tyk) oven på rugekammeret. Optag differential interferens kontraert mikroskopi billeder af GV'er. Optag mikroskopi billeder af vesiklerne med et mikroskop (10X, 20X, 40X og mål) udstyret med en 12V100WHAL-L halogenlampe. Gennemføre fluorescens mikroskopi observationer. Indsæt U-FBNA og U-FMCHE fluorescens spejl enheder ind i mikroskopet. Monter enhederne med 470-495 nm og 565-585 nm excitation filtre, henholdsvis og med emissionsfiltre der sender 510-550 nm og 600-690 nm lys, hhv.

Representative Results

Vand / olie-emulsion centrifugering fremgangsmåde er vist fotografisk og skematisk i figur 1. Den skematiske billede i figur 1 antyder, at den vigtigste faktor for succesen af denne fremgangsmåde er, at densiteten af den indre vandige opløsning skal være større end den ydre vandige opløsning, således at GV'er vil udfælde under centrifugering. Desuden dannelsen af ​​et lipid monolag på w / o-grænsefladen kræver, at systemet nedkøles i 10 min efter emulsionen er lagdelt på den ydre vandige opløsning. Fordi GV'er form ved overførsel af emulsionsdråber tværs af w / o interface, skal de osmotiske tryk i de indre og ydre vandige faser være den samme. Som et kontrolforsøg vi også tilberedt GV'er indeholder ingen mikrosfærer ved hjælp af fremgangsmåden vist i figur 1 og trin 1.3, bortset fra, at den indre vandige opløsning varfremstillet uden mikrosfærer. Indsamling af de udfældede GV'er efter centrifugering er vist i figur 2. Ud over den semitransparente fase i bunden af mikrorør, vi også observeret en hvid, uklar mellemliggende fase i den ydre vandige opløsning (figur 2a). Dette mellemliggende fase var rig på aggregeringer af mikrokugler og olie, mens den nederste fase indeholdt GV'er. Derfor efter gennemboring bunden af mikrorør med en kortnål (figur 2b), vi kun indsamles den første dråbe (figur 2c), som indeholdt store mængder GV'er. Det er vigtigt at sørge for, at der ikke er mere end to dråber, indsamles eventuelle yderligere dråber kan indeholde samlinger af mikrokugler og lipider, som vil resultere i en lavere tæthed af GV'er. Den opnåede vesikulær dispersion ofte indeholdt indkapslede materialer uden for GV'er fordi GV'er oftenn brud under centrifugering. At opnå kun GV'er, et sorteringsanlæg fremgangsmåde, såsom dialyse, gelfiltrering eller fluorescens-aktiveret cellesortering bør vælges på grund størrelserne af indkapslingsmaterialer. Hvis det er nødvendigt for det formål, hvortil de udfældede GV'er skal anvendes, kan de fortyndes med den ydre vandige opløsning. I nogle tilfælde, den mellemliggende fase udvides til bunden af ​​røret, hvilket antyder, at nogen vesikler, der blev dannet, blev holdt sammen af ​​olien. Vi opnåede differential interferens mikroskopi og fluorescens mikroskopi billeder af GV'er uden mikrosfærer (Fig 3a, 3b) og med mikrokugler (figur 3c -3 f). Overensstemmelse med tidligere rapporter 23, 37, blev GV'er med lav lamellarity dannet af vores protokol. Lipider konjugeret med Texas Red DHPE, der udsender røde Lysstofrørblomsterstand, blev anvendt således, at vesikeldannelse direkte kunne bekræftes ved visualisering af den tynde membran. Af de 160 GV'er, vi opnåede, 55 indkapslede mikrokugler og 105 var tomme, hvilket giver et forhold på indkapsling på 34%. Vi bestemt volumen fraktion (φ, vol%) af mikrokugler i GV'er ved hjælp af følgende metode. Fordi hver GV indeholder snesevis til flere hundrede mikrokugler, tælle alle de mikrosfærer under et optisk mikroskop er udfordrende. Derfor blandede vi de ikke-fluorescerende 1,0 um mikrosfærer med en lille mængde af fluorescerende mikrokugler, der manuelt blev talt under fluorescensmikroskop. Det samlede antal (N) af indkapslede mikrokugler blev beregnet ved at gange antallet (n) af manuelt optalt fluorescerende mikrosfærer med 20 (baseret på den oprindelige 95: 5 [v / v] forholdet mellem ikke-fluorescerende til fluorescerende mikrosfærer). Værdien af66; blev derefter beregnet som Nv 100 / V, hvor V er rumfanget af mikrokuglerne og V er rumfanget af den individuelle GV. Bemærk, at estimering af N fra n giver anledning til at tælle fejl, og der skal tages hensyn til disse fejl ved beregningen af φ. Værdien af φ blev anslået ud fra N, som blev direkte beregnet som 20 n, og dette igen resulterede i sandsynligheden for, at Ø præcist repræsenterer den sande værdi er <50%. Faktisk N svinger til en vis grad omkring 20 n, så vi nødt til at overveje det som 20 (n ± i), hvor i er fejl i n. Vi skønnede jeg, for at en sandsynlighed for n ± jeg kunne være mere end 50% opnået på grundlag af en Poisson-fordeling. Vi vurderede jeg, som igen tilladt os at beregne 20 (n ± i) og værdier af66; der omfattede tælle fejl, for GV'er med en diameter på 10 og 15 pm (tabel 1). Ifølge denne procedure blev den del af mikrosfærer i GV vist i figur 3C volumen estimeret til 11 ± 3 vol-%. Præcisionen af ​​den beregnede fraktion volumen var 10-30%. Vores resultater viser, at vi med succes indkapslet 1 um mikrosfærer i GVS ved høj volumenfraktion. Vi var også i stand til at indkapsle andre materialer i 100 mol-% DOPC GV'er anvendelse af den samme ydre vandige opløsning og den samme protokol (figur 4). Specifikt blev GV'er indeholdende 0,1 um mikrosfærer fremstillet ud fra en Tris-bufferopløsning, der indeholder 0,1 M Tris-HCl (pH 7,5), 0,15 M sucrose, og 0,5 vol-% fluorescerende mikrosfærer ved hjælp af protokollen beskrevet for GV'er indeholdende 1,0 um mikrosfærer ( Figur 4a). Efter protokollen beskrevet above, DOPC GV'er indeholdende GFP (0,1 M Tris-HCI [pH 7,5], 0,15 M saccharose, og 100 ug / ml GFP, figur 4b) og GV'er indeholder uranine (0,1 M Tris-HCI [pH 7,5], 0,15 M saccharose, og 30 uM uranine, figur 4c) blev også fremstillet. n N φ (10 um diameter) φ (15 um diameter) 3 60 ± 20 6,0 ± 2,0 1,8 ± 0,6 4 80 ± 20 8,0 ± 2,0 2,4 ± 0,6 5 100 ± 20 10 ± 2 3,0 ± 0,6 6 120 ± 30 12 ± 4 3,6 ± 1,2 10 200 ± 32 20 ± 3 Fem.9 ± 0,9 20 400 ± 45 40 ± 5 12 ± 2 30 600 ± 55 – 18 ± 2 en fejl blev bestemt som beskrevet i teksten; n = antallet af manuelt optalte mikrosfærer; N = samlet antal indkapslede mikrokugler. Tabel 1: Tal og Volume Brøker (φ, vol%) af Mikrosfærer a. en fejl blev bestemt som beskrevet i teksten; n = antallet af manuelt optalte mikrosfærer; N = samlet antal indkapslede mikrokugler. Figur 1: Flow Ch kunst og skematisk afbildning af W / O Emulsion Centrifugering Method. (A) Olie opløsning bestående af DOPC og Texas Red DHPE (100: 0,3 molforhold) i flydende paraffin. (B) indre vandige dispersion bestående af saccharose og mikrokugler i Tris-HCI-buffer. (C) ydre vandige opløsning bestående af glucose i Tris-HCI-buffer. (D) blanding af 1 ml olie-opløsning og 300 pi indre vandige dispersion. (E) Emulgering med en homogenisator (10.000 rpm, 2 minutter). (F) w / o-emulsion. (G) Lagdeling af 300 pi emulsionen på 1 ml af den ydre vandige opløsning. (H) Udfældet GV'er lige efter centrifugering. (I) Skematisk afbildning af princippet om v / o-emulsion centrifugering metode. Den sorte pil angiver retningen af ​​centrifugal acceleration..jpg "target =" _ blank "> Klik her for at se en større version af dette tal. Figur 2: Piercing af mikrorør. (A) Udfældet GV'er lige efter centrifugering (også afbildet i figur 1 h). Den røde ellipse angiver dråbe af det udfældede GV dispersion. (B) Piercing af mikrorør med en kortnål. Pelleten indeholdende GV'er blev opnået ved piercing mikrorør nær bunden med en kortnål og opsamling dråber fra hullet. (C) Droplet af de udfældede GV'er (angivet af den gule pil) dispersion fortyndet med den ydre vandige opløsning. Klik her for at se en større version af dette tal. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-side = "1"> Figur 3: Mikroskopi Billeder af GV'er. (A) Differential interferens kontrast mikroskopi billede af en GV uden mikrosfærer. Diameteren af ​​GV var omkring 10 um. Scale bar = 10 um. (B) Fluorescensmikroskopi billede af en GV uden mikrosfærer. Den røde fluorescens blev udsendt af Texas Red DHPE. (C) Differential interferens kontrast mikroskopi billede af en GV mikrosfærer. (D) Fluorescensmikroskopi billede af 1,0 um mikrosfærer (YG carboxylatgrupper mikrokugler) inde i en GV. Antallet af optalte fluorescerende mikrosfærer (n) var 6. Vi estimerede fejlene (i = 2) baseret på Poisson-fordeling. Derefter anslås vi samlede antal indvendige mikrokugler (N = 20 (n ± i)) var 120 ± 40. Det blev beregnet, atGV indeholdt 1,0 um mikrosfærer i en volumenfraktion (φ = Nv 100 / V) på ca. 11 ± 3 vol%, hvor V er rumfanget af mikrokuglerne og V er rumfanget af GV'er. (E) Fluorescensmikroskopi billede af en GV membran. Den røde fluorescens blev udsendt af Texas Red DHPE. (F) sammenflettede billede af billederne i panelerne d og e. Klik her for at se en større version af dette tal. Figur 4: Differential Interference Kontrast og fluorescensmikroskopi Billeder af GV'er med forskellige indkapslede materialer. Differential interferens kontrast mikroskopi (øverst) og fluorescensmikroskopi (bund) billeder afGV'er indeholdende (a) 0,1 um mikrosfærer, (b) GFP, og (c) uranine. Scale barer = 10 um. Klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

De massefylder af den indre vandige dispersionsmedium og den ydre vandige opløsning skal vælges med omhu. For vand / olieemulsion at udfælde i den ydre vandige opløsning under centrifugering, skal massefylden af ​​den indre vandige dispersionsmedium være større end den ydre vandige opløsning. Vi forsøgte at forberede GV'er der anvender indre og ydre opløsninger uden sukker, men vi opnåede ingen GV'er under disse betingelser, fordi den indre vandige opløsning ikke havde tilstrækkelig masse til at krydse interferens mellem de to faser. Hvis der er en stor forskel osmotisk tryk mellem de to opløsninger, GV'er der udfældes i den ydre vandige opløsning kan krympe eller brud. Derfor skal det osmotiske tryk i og uden for GV'er være lige. For at opnå dette, brugte vi saccharose som et opløst stof i den indre vandige dispersion og glucose som et opløst stof i den ydre vandige opløsning; både sukker var på samme koncentration. Både saltss = "xref"> 22 og sukker ^{23, 35, 38} er blevet anvendt til sådanne formål, men sukker anvendes sædvanligvis, fordi det er mindre toksisk og mere opløseligt end salt. Men hvis der tilsættes for meget sukker, kan GV'er komme i kontakt med bunden af ​​dækglasset og kollaps. Der er flere strategier for at undgå dette. Én strategi er at reducere massefylden forskellen mellem de indre og ydre vandige opløsninger, således at GV'er udfældes under milde betingelser; specifikt kan supernatanten af ​​det udfældede GV dispersion udveksles med en løsning, der er identisk med den indre vandige opløsning for at reducere muligheden for vesikulær brud ved klæbning til dækglasset som følge af opdrift. En anden strategi er at precoat begge dækglas med en tynd lipidfilm ^29.

Korrekt forberedelse og inkubation af emulsionen ervigtig. Vi anvendte flydende paraffin til fremstilling af olieopløsning. Mineralolie ^{26, 31,} dodecan ^{21, 33,} og squalan ^{33, 39} er også ofte brugt som opløsningsolier. Fordi disse materialer varierer i massefylde, viskositet og overfladespænding, forskellige antal vesikler dannes, selv når der anvendes de samme centrifugeringsbetingelser ^33. Til opnåelse vesiklerne med mål egenskaber, er det vigtigt at optimere massefylder og viskositeter de indre og ydre vandige opløsninger samt centrifugal acceleration.For fremstilling af oliefasen, skal inkubation forekomme ved høj temperatur og i et tørt miljø, såsom en inkubator eller en dehydrator. I denne undersøgelse har vi opvarmede flydende paraffin til 80 ° C for at opløse lipid molecules.In Desuden bør emulsionenfremstilles kun efter behov, og bør straks underkastet centrifugering, fordi det er ustabilt lige efter det er fremstillet, og vand / olie dråber let fusionerer med hinanden. Emulsionen kan tilberedes i store mængder ved lydbehandling, vortexbehandling eller aflytning. Men anvendelse af en homogenisator tillader hurtig fremstilling af store mængder af emulsion og lettere emulgering i olie med en høj viskositet. Det er også vigtigt, at emulsionen lægges i lag på den ydre vandige opløsning forsigtigt og hurtigt, og derefter afkølet ved 4 ° C. For at afkorte tiden mellem emulgering og centrifugering, kan olie-ydre vandige opløsning systemet forud afkølet før emulsionen er lagdelt på det, og hele systemet kan derefter centrifugeres immediately.If den hvide uklarhed forekommer hurtigere eller langsommere end normalt, den mekaniske homogenisator skal skylles grundigt for at fjerne rengøringsmidler. Derudover før emulgering, skal olien opløsning, indre vandige opløsning, og emulgator være returned til stuetemperatur.

Korrekt centrifugalacceleration er også vigtig. Ved centrifugering ved 18.000 x g, var vi i stand til at fremstille GV'er med en enkelt indvendig materiale indkapslet i en høj koncentration. Når indkapslingen af ​​flere materialer er påkrævet, er det bedre at reducere den centrifugale acceleration. For eksempel blev et actin montagesystem indkapsler syv forbindelser opnås med centrifugering ved mindre end 350 x g ^35. I tilfælde, hvor centrifugering er uønsket, kan GV'er opnås ved at justere koncentrationen af sukker eller ved at udfælde emulsionen under indflydelse af sin egen vægt ^{38, 40, 41.}

Fremgangsmåden rapporterede heri har to store begrænsninger. Den ene er at olie- molekyler (paraffin, i dette tilfælde) kan solubiliseres i GV membranen, som det er blevet påpeget Weitz gruppe ^21. Når der ønskes insertion af et membranprotein i GV membranen, skal virkningerne af sameksisterende oliemolekyler på proteinet overvejes. Den anden begrænsning er variationen af ​​volumenfraktion. I denne undersøgelse, vi vurderet, at volumenbrøkerne af mikrokugler i GV'er varierede fra 4-30 vol%; volumenbrøkerne var ikke identisk med den del af den indre vandige opløsning, der anvendes til GV fremstilling volumen. Selvom vi var i stand til at indkapsle mikrosfærer i GV'er på en volumenfraktion høj nok til mikroskopi observation er denne metode ikke egnet til fremstilling af GV'er med en ensartet fordeling volumenfraktion. Det er blevet rapporteret, at fordelingen af mikrokugle volumenfraktioner skifter under centrifugering ^34.

Vand / olie-emulsion centrifugering metode er almindeligt anvendt til dannelse af GV'er indeholder indkapslede materialer. Imidlertid har få rapporter beskrevet perstatning af GVS indkapsler mikroskala materialer ^{34, 42.} For nylig har molekylære robotter indeholdende en indkapslet DNA-enhed eller en molekylær enhed blevet konstrueret ^{43, 44.} GV'er med rum er det første valg for disse former for applikationer; derfor kan teknikker, såsom vores, der kunne bruges til indkapsling af magnetiske mikrokugler og mikrosfærer med forskelligartet overflade funktionalisering forventes at være anvendelige ^44.

Materials

REAGENTS:
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)	Avanti Polar Lipids	850375C	Vesicular membrane molecule
Texas Red 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, triethylammonium salt (Texas Red DHPE)	Thermo Fisher Scientific	T1395MP
Liquid paraffin	Wako Pure Chemical Industries	128-04375	Oil, Density (20℃) 0.86 -0.89 g/mL
1 M Tris-HCl (pH 7.5)	Nippon Gene Co.	318-90225	Buffer solution
D(+)-Glucose	Wako Pure Chemical Industries	049-31165	For outer water solution
Sucrose	Wako Pure Chemical Industries	196-00015	For inner water solution
Polybead carboxylate microspheres 1.0 µm	Polysciences	08226-15	Nonfluorescent, 2R = 1.0 µm
Fluoresbrite YG carboxylate microspheres 1.0 µm	Polysciences	15702-10	Fluorescent, 2R = 1.0 µm
Fluoresbrite YG carboxylate microspheres 0.10 µm	Polysciences	16662-10	Fluorescent, 2R = 0.10 µm
Fluorescein sodium salt (uranine)	Sigma Aldrich Japan	F6377-100G
GFP standard (recombinant)	Vector Laboratories	MB-0752
Name	Company	Catalog Number	Comments
EQUIPMENT:
Centrifuge 5427R	Eppendorf	5409000233	Centrifuge rotor: FA-45-48-11
Physcotron	Microtec Co.	NS-310EIII	Handy micro-homogenizer
Generator shaft	Microtec Co.	NS-4	Homogenizer attachment
Frame-Seal incubation chambers for in situ PCR and hybridization	Bio-Rad Laboratories	SLF0201	Hybridization chamber volume: 25 µL Chamber size: 9 × 9 × 0.3 mm
Frame-Seal incubation chambers for in situ PCR and hybridization	Bio-Rad Laboratories	SLF0601	Hybridization chamber volume: 65 µL           Chamber size: 15 × 15 × 0.3 mm
Microman E	Gilson	FD10006	Pipette for viscous liquid. We measured liquid paraffin by using this.
Inverted microscope	Olympus Co.	IX73
Mirror unit	Olympus Co.	U-FBNA	Excitation filter: 470-495 nm Emission filter: 510-550 nm
Mirror unit	Olympus Co.	U-FMCHE	Excitation filter: 565–585 nm Emission filter: 600-690 nm