Giant vesicles containing highly packed micrometer-sized components are useful cell models. The water-in-oil emulsion centrifugation method is a simple, powerful tool for the preparation of giant vesicles with encapsulated materials.
Den konstruktive biologi og syntetisk biologi tilgang til at skabe kunstigt liv indebærer bottom-up samling af biologiske eller ikke-biologiske materialer. Sådanne tilgange har fået betydelig opmærksomhed i forskningen på grænsen mellem levende og ikke levende stof og er blevet brugt til at konstruere kunstige celler i de seneste to årtier. Især har Giant Vesikler (GV'er) ofte blevet anvendt som kunstige cellemembraner. I dette papir, vi beskriver fremstillingen af GV'er indkapsler stærkt pakket mikrokugler som en model af celler indeholdende kondenserede biomolekyler. De GV'er blev fremstillet ved hjælp af en simpel vand-i-olie-emulsion centrifugering metode. Specifikt blev en homogenisator anvendes til at emulgere en vandig opløsning indeholdende de materialer, der skal indkapsles, og en olie indeholdende opløste phospholipider, og den resulterende emulsion blev lagt forsigtigt på overfladen af en anden vandig opløsning. Den lagdelte system blev derefter centrifugeret to generere GV'er. Denne kraftfulde metode blev anvendt til at indkapsle materialer lige fra små molekyler til mikrosfærer.
Den konstruktive, eller syntetisk, biologi tilgang er en fascinerende avenue for at udforske grænsen mellem levende og ikke levende stof. Fordi cellen er den mindste, som kræves til liv, som vi i øjeblikket forstår det, forskellige forskere har forsøgt at konstruere kunstige celler fra enkle, godt forståede kemikalier, så fænomener, der opstår inden for sådanne kunstige celler kan studeres, med det ultimative mål at belyse livets oprindelse og studere de grundlæggende funktioner af levende celler 1, 2, 3. Især vesikler 4, som er sfæriske microcompartments fremstillet af amfifile molekyler og kan indkapsle biologiske molekyler, såsom proteiner 5, 6 og DNA 7, 8, 9,lass = "xref"> 10, er ofte blevet brugt som modeller for biologiske membraner.
Vesikler kan klassificeres som små (defineret som har en diameter på <100 nm), stor (diameter <1 um), eller kæmpe (diameter> 1 um). Giant vesikler (GVS) er blevet omfattende undersøgt, fordi de ligner levende celler i størrelse, form og struktur. På grund af størrelsen af GV'er, kan let observeres morfologiske ændringer i GV membraner i realtid under et optisk mikroskop.
Adskillige fremgangsmåder til fremstilling GV'er er blevet rapporteret 11, herunder hydrering metode 12, 13, fryse-tø-metoden 14, den electroformation metode 15, 16, og den fluidindretning metode 17, 18. Men indkapsler protein og andre MACROMolecules i GVS ved høje koncentrationer ved hjælp af disse metoder er vanskelig. Navnlig er det ekstremt udfordrende at indkapsle biologiske materialer i en sådan mængde (20-30 vol%) for at efterligne den overfyldt miljø inde celler 19, 20. Til dannelse GV'er øjeblikkeligt, Weitz og medarbejdere etableret en vand-i-olie (v / o) emulsion centrifugering metode 21, 22. Denne metode har fem vigtige funktioner. Først, fordi GV'er fremstillet ved denne fremgangsmåde har lav lamellarity 23, 24, deres membraner er så tynde, at de kan deformeres let. GV membran deformation induceret af FtsZ (en bakteriel celledeling protein), tubulin, og andre makromolekyler er blevet undersøgt 25, 26, 27, 28, og vi observerede polyhe Dron-lignende deformation af GV membraner induceret ved indkapsling af mikrokugler 29, 30. For det andet kan membranproteiner indsættes i vesikulær membran ved denne metode, omend med besvær 31. For eksempel Yomo gruppe brugt denne metode til at studere in vitro-syntese og poredannende aktivitet af membranproteinet α-hæmolysin 32. Det tredje er det muligt at generere asymmetriske GV'er hvor lipidbestanddele i de indre og ydre foldere er forskellige 22. F.eks Whittenton et al. genereret asymmetriske GV'er med kationiske lipider i den indre folder at indkapsle negativt ladede polynucleotider, og med neutrale lipider på den ydre folder for at reducere toksicitet og uspecifik cellulær optagelse 33. For det fjerde kan koncentrationen og volumen fraktion af stoffer inde i GV'er være relativt højs = "xref"> 28, 34. Femte, kan flere typer af materialer indkapsles 35. For eksempel, Nishimura et al. indkapslet en in vitro-transskription-translationssystem i GV'er og brugt systemet til at udtrykke grønt fluorescerende protein (GFP) i GV'er 36. Disse fem funktioner gør v / o-emulsion centrifugering en uundværlig metode til generering af celle-efterlignende GV'er.
I tidligere arbejde blev GV'er genereret ved centrifugering opsamles ved hjælp af en sprøjte udstyret med en lang 16 G kanyle af rustfrit stål indeholdende noget af den endelige vandige opløsning 22. I hænderne på uerfarne teknikere, kunne denne samling metode let føre til forurening af GV med noget af olien. I denne undersøgelse anvendte vi v / o-emulsion centrifugering protokol udviklet af den Yomo gruppe 23, 37,hvori opsamles udfældede GV'er gennem et hul åbnet i bunden af centrifugeglasset, hvori de er fremstillet. Vi forberedte GV'er indkapsler 1,0 um mikrosfærer, som er på størrelse med intracellulære organeller. Anvendelsen af mikrokugler tilladt os at estimere koncentrationen ved at beregne deres volumenfraktion. Etablering af en metode til fremstilling af GV'er hvor materialer er tæt pakket er et vigtigt skridt for at skabe kunstige celler. For at bekræfte anvendeligheden af vores protokol af forskellige former for indre materialer, vi viste også, at GFP og et lille vandopløseligt fluorescerende molekyle (uranine) kunne indkapsles i GV'er.
De massefylder af den indre vandige dispersionsmedium og den ydre vandige opløsning skal vælges med omhu. For vand / olieemulsion at udfælde i den ydre vandige opløsning under centrifugering, skal massefylden af den indre vandige dispersionsmedium være større end den ydre vandige opløsning. Vi forsøgte at forberede GV'er der anvender indre og ydre opløsninger uden sukker, men vi opnåede ingen GV'er under disse betingelser, fordi den indre vandige opløsning ikke havde tilstrækkelig masse til at krydse interferens mellem de to faser. Hvis der er en stor forskel osmotisk tryk mellem de to opløsninger, GV'er der udfældes i den ydre vandige opløsning kan krympe eller brud. Derfor skal det osmotiske tryk i og uden for GV'er være lige. For at opnå dette, brugte vi saccharose som et opløst stof i den indre vandige dispersion og glucose som et opløst stof i den ydre vandige opløsning; både sukker var på samme koncentration. Både saltss = "xref"> 22 og sukker 23, 35, 38 er blevet anvendt til sådanne formål, men sukker anvendes sædvanligvis, fordi det er mindre toksisk og mere opløseligt end salt. Men hvis der tilsættes for meget sukker, kan GV'er komme i kontakt med bunden af dækglasset og kollaps. Der er flere strategier for at undgå dette. Én strategi er at reducere massefylden forskellen mellem de indre og ydre vandige opløsninger, således at GV'er udfældes under milde betingelser; specifikt kan supernatanten af det udfældede GV dispersion udveksles med en løsning, der er identisk med den indre vandige opløsning for at reducere muligheden for vesikulær brud ved klæbning til dækglasset som følge af opdrift. En anden strategi er at precoat begge dækglas med en tynd lipidfilm 29.
Korrekt forberedelse og inkubation af emulsionen ervigtig. Vi anvendte flydende paraffin til fremstilling af olieopløsning. Mineralolie 26, 31, dodecan 21, 33, og squalan 33, 39 er også ofte brugt som opløsningsolier. Fordi disse materialer varierer i massefylde, viskositet og overfladespænding, forskellige antal vesikler dannes, selv når der anvendes de samme centrifugeringsbetingelser 33. Til opnåelse vesiklerne med mål egenskaber, er det vigtigt at optimere massefylder og viskositeter de indre og ydre vandige opløsninger samt centrifugal acceleration.For fremstilling af oliefasen, skal inkubation forekomme ved høj temperatur og i et tørt miljø, såsom en inkubator eller en dehydrator. I denne undersøgelse har vi opvarmede flydende paraffin til 80 ° C for at opløse lipid molecules.In Desuden bør emulsionenfremstilles kun efter behov, og bør straks underkastet centrifugering, fordi det er ustabilt lige efter det er fremstillet, og vand / olie dråber let fusionerer med hinanden. Emulsionen kan tilberedes i store mængder ved lydbehandling, vortexbehandling eller aflytning. Men anvendelse af en homogenisator tillader hurtig fremstilling af store mængder af emulsion og lettere emulgering i olie med en høj viskositet. Det er også vigtigt, at emulsionen lægges i lag på den ydre vandige opløsning forsigtigt og hurtigt, og derefter afkølet ved 4 ° C. For at afkorte tiden mellem emulgering og centrifugering, kan olie-ydre vandige opløsning systemet forud afkølet før emulsionen er lagdelt på det, og hele systemet kan derefter centrifugeres immediately.If den hvide uklarhed forekommer hurtigere eller langsommere end normalt, den mekaniske homogenisator skal skylles grundigt for at fjerne rengøringsmidler. Derudover før emulgering, skal olien opløsning, indre vandige opløsning, og emulgator være returned til stuetemperatur.
Korrekt centrifugalacceleration er også vigtig. Ved centrifugering ved 18.000 x g, var vi i stand til at fremstille GV'er med en enkelt indvendig materiale indkapslet i en høj koncentration. Når indkapslingen af flere materialer er påkrævet, er det bedre at reducere den centrifugale acceleration. For eksempel blev et actin montagesystem indkapsler syv forbindelser opnås med centrifugering ved mindre end 350 x g 35. I tilfælde, hvor centrifugering er uønsket, kan GV'er opnås ved at justere koncentrationen af sukker eller ved at udfælde emulsionen under indflydelse af sin egen vægt 38, 40, 41.
Fremgangsmåden rapporterede heri har to store begrænsninger. Den ene er at olie- molekyler (paraffin, i dette tilfælde) kan solubiliseres i GV membranen, som det er blevet påpeget Weitz gruppe 21. Når der ønskes insertion af et membranprotein i GV membranen, skal virkningerne af sameksisterende oliemolekyler på proteinet overvejes. Den anden begrænsning er variationen af volumenfraktion. I denne undersøgelse, vi vurderet, at volumenbrøkerne af mikrokugler i GV'er varierede fra 4-30 vol%; volumenbrøkerne var ikke identisk med den del af den indre vandige opløsning, der anvendes til GV fremstilling volumen. Selvom vi var i stand til at indkapsle mikrosfærer i GV'er på en volumenfraktion høj nok til mikroskopi observation er denne metode ikke egnet til fremstilling af GV'er med en ensartet fordeling volumenfraktion. Det er blevet rapporteret, at fordelingen af mikrokugle volumenfraktioner skifter under centrifugering 34.
Vand / olie-emulsion centrifugering metode er almindeligt anvendt til dannelse af GV'er indeholder indkapslede materialer. Imidlertid har få rapporter beskrevet perstatning af GVS indkapsler mikroskala materialer 34, 42. For nylig har molekylære robotter indeholdende en indkapslet DNA-enhed eller en molekylær enhed blevet konstrueret 43, 44. GV'er med rum er det første valg for disse former for applikationer; derfor kan teknikker, såsom vores, der kunne bruges til indkapsling af magnetiske mikrokugler og mikrosfærer med forskelligartet overflade funktionalisering forventes at være anvendelige 44.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker Tomoko Yamaguchi til at trække den skematiske billede i figur 1. Denne undersøgelse blev støttet af Okazaki ORION Project af Okazaki Institute for Integrative Bioscience af Det Nationale Institutes of Natural Sciences (Nins); af Astrobiology center Project (ingen AB281010.) af Nins; af en Grant-in-Støtte til videnskabelig forskning om innovative områder (Dynamisk bestilling af biomolekylære systemer til etablering af integrerede funktioner) fra Japan Society for fremme af Science (JSP'er) (ingen 25.102.008.); af en Grant-in-Aid for Unge Forskere (B) (til KK, ingen 15K17850.) fra JSP'er; andby en Grant-in-Støtte til forskning Activity Opstart (til YN, nr. 15H06653) fra JSP'er. Yderligere støtte blev leveret af en bevilling fra Noguchi Institute, en bevilling fra Kao Foundation for Arts and Sciences, og en bevilling fra Kurita Vand og Miljø Foundation.
REAGENTS: | |||
1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375C | Vesicular membrane molecule |
Texas Red 1,2-dihexadecanoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine, triethylammonium salt (Texas Red DHPE) | Thermo Fisher Scientific | T1395MP | |
Liquid paraffin | Wako Pure Chemical Industries | 128-04375 | Oil, Density (20℃) 0.86 -0.89 g/mL |
1 M Tris-HCl (pH 7.5) | Nippon Gene Co. | 318-90225 | Buffer solution |
D(+)-Glucose | Wako Pure Chemical Industries | 049-31165 | For outer water solution |
Sucrose | Wako Pure Chemical Industries | 196-00015 | For inner water solution |
Polybead carboxylate microspheres 1.0 µm | Polysciences | 08226-15 | Nonfluorescent, 2R = 1.0 µm |
Fluoresbrite YG carboxylate microspheres 1.0 µm | Polysciences | 15702-10 | Fluorescent, 2R = 1.0 µm |
Fluoresbrite YG carboxylate microspheres 0.10 µm | Polysciences | 16662-10 | Fluorescent, 2R = 0.10 µm |
Fluorescein sodium salt (uranine) | Sigma Aldrich Japan | F6377-100G | |
GFP standard (recombinant) | Vector Laboratories | MB-0752 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
EQUIPMENT: | |||
Centrifuge 5427R | Eppendorf | 5409000233 | Centrifuge rotor: FA-45-48-11 |
Physcotron | Microtec Co. | NS-310EIII | Handy micro-homogenizer |
Generator shaft | Microtec Co. | NS-4 | Homogenizer attachment |
Frame-Seal incubation chambers for in situ PCR and hybridization | Bio-Rad Laboratories | SLF0201 | Hybridization chamber volume: 25 µL Chamber size: 9 × 9 × 0.3 mm |
Frame-Seal incubation chambers for in situ PCR and hybridization | Bio-Rad Laboratories | SLF0601 | Hybridization chamber volume: 65 µL Chamber size: 15 × 15 × 0.3 mm |
Microman E | Gilson | FD10006 | Pipette for viscous liquid. We measured liquid paraffin by using this. |
Inverted microscope | Olympus Co. | IX73 | |
Mirror unit | Olympus Co. | U-FBNA | Excitation filter: 470-495 nm Emission filter: 510-550 nm |
Mirror unit | Olympus Co. | U-FMCHE | Excitation filter: 565–585 nm Emission filter: 600-690 nm |