בידוד והעשרה של קבוצות משנה כבדים ובתאים המזוהים על ידי שילוב מרקר Surface Novel
Summary
פציעות כבדות מלוות הרחבת תא ובתאים מייצגים אוכלוסייה הטרוגנית תא. סיווג רומן של תא הסלולר זה מאפשר הבחנה של תת מרובים. השיטה המתוארת כאן ממחישה את הזרימה cytometry ניתוח ובידוד טוהר גבוה של תת שונים שיכול לשמש מבחנים נוספים.
Abstract
במהלך פציעות כבדות כרוניות, ובתאים להרחיב בתהליך הנקרא תגובת ductular, אשר כרוך גם ההופעה חודר לתוך הסלולר דלקתי הפעלה תא אפיתל. אוכלוסיית התאים ובתאים במהלך תגובות דלקתיות כגון בעיקר נחקרה באמצעות סמני משטח אחד, בין אם על ידי ניתוח היסטולוגית או על ידי זרימת טכניקות cytometry מבוסס. עם זאת, סמני משטח רומן זיהו שונה תת ברורים מבחינה תפקודית בתוך ובתאים הכבדים / גזע תא תא. השיטה המוצגת כאן מתארת את הבידוד זרימת מפורט cytometry ניתוח של תת ובתאים באמצעות שילובים סמן משטח הרומן. יתר על כן, הוא מדגים כיצד תת תאים ובתאים השונים יכול להיות מבודד עם טוהר גבוה באמצעות אוטומטיות מגנט FACS שיטות מיון מבוסס. חשוב לציין, הרומן דיסוציאציה האנזימטית פשוטה של הכבד מאפשר בידוד של אוכלוסיות תאים נדירות אלה עם כדאיות גבוההכי עדיף בהשוואה לשיטות קיימות אחרות. זה רלוונטי במיוחד ללימוד נוסף ובתאים במבחנה או לבידוד RNA באיכות גבוהה לנתח את פרופיל ביטוי גנים.
Introduction
התחדשות כבדה מזוהית בעיקר עם קיבולת החידוש העצמי של hepatocytes. עם זאת, פציעות כבדות כרוניות להתרחש עם הפעלת תא אב והתרחבות, אשר נקשרו עם יכולת להתמיין hepatocytes ו cholangiocytes 1, 2, 3, 4. זה רלוונטי במיוחד כי, במהלך פציעות כרוניות, התפשטות hepatocyte אינה יעילה. למרות מחקרי מעקב גנטי מיקוד מרובים ובתאים, תפקידם ההתחדשות כבדה נשאר שנוי במחלוקת 5, 6, 7, 8. יתר על כן, ההפעלה ובתאים נקשרה בתגובת fibrotic גדלה בכבד, מה שמעלה שאלות לגבי תפקידם המדויק במהלך פציעות 9, 10.
האופי ההטרוגני של תא תא האב הוצע ארוך על ידי מחקרי התבטאות גנים מבודדים ובתאים להביע סמן משטח יחיד באמצעות microdissection או מיון תא מבוסס שיטות 1, 11. ואכן, לאחרונה, שילוב סמן משטח רומן באמצעות gp38 (podoplanin) מקושר באופן חד משמע סמנים יחידים קודמים של ובתאים כדי תת שונה 12. חשוב לציין, תת אלה לא היו שונים רק הביטוי סמן פני השטח שלהם, אלא גם הציג שינויים תפקודיים במהלך פציעות 12.
במודלים של בעלי חיים מרובים כבר נוצל כדי לחקור הפעלת תא אב והתחדשות כבדה. נראה כי סוגי הפציעה השונים לקדם את ההפעלה שונה תת קבוצות של ובתאים 12. זה עשוי להסביר את phהבדלי enotypic תגובת ductular שנצפתה אצל בני אדם 4. לפיכך, פנוטיפי מורכבים והניתוחים תפקודיים של ובתאים הם מרכזיים להבין את תפקידם פציעות ואת המשמעות האמיתית של תגובת ductular במחלות כבדות.
מלבד שילובים סמן משטח, ההבדלים המכריעים פרוטוקולי בידוד תא לסבך עוד יותר את המסקנות בהתבסס על מחקרים קודמים 2. חלק גדול ממאגרי נפט המחקרים התייחסו התפקיד של ובתאים כי שונים מאוד בפרוטוקול בידודם (למשל, דיסוציאציה הכבד (שילוב אנזים ומשך התהליך), בינוני צפיפות, ומהירות צנטריפוגה) 2. טכניקת בידוד אופטימיזציה, מתן כדאיות טובה יותר עבור אוכלוסיות תאים נדירות ומהורהרת של רכב משנה, פותחה ופורסמה 12 לאחרונה. מטרת מאמר זה היא לספק יותר detפרוטוקול שמציק של הליך בידוד תא הכבד הזה ואת ניתוח המשנה כדי לאפשר הרבייה הנכונה של הטכניקה. בנוסף, הפרוטוקול כולל השוואה עם שיטת הבידוד הקודמת המצביעים על ההבדלים לעומת הפרוטוקול החדש.
Protocol
Representative Results
Discussion
דלקת כבד ופציעתם של מקורות שונים לעורר תהליכי התחדשות בכבד אשר מלווה בהרחבת תא אב והפעלה 2, 3. ובתאים בכבד אלה יש גזע אופייני תא סביר לשחק תפקיד משמעותי pathomechanism של מחלות כבד שונות.
ההטרוגניות של תאי ?…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי פרס אלכסנדר פון הומבולדט קרן Sofja Kovalevskaja כדי VLK.
Materials
| RPMI | Life Technologies | 21875-034 | |
| phenol red free DMEM | Life Technologies | 31053-028 | |
| FBS | Life Technologies | 10270-106 | |
| Collagenase P | Sigma-Aldrich | 11249002001 | |
| DNAse-I | Sigma-Aldrich | 10104159001 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105041 | |
| ACK Lysing Buffer | Life Technologies | A10492-01 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025-050 | |
| PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Sodium Azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Prepare 1 % stock solution |
| 10 % BSA | Miltenyi Biotec | 130-091-376 | |
| autoMACS Rinsing Solution | Miltenyi Biotec | 130-091-222 | add 0.5 % (v/v) BSA and store on ice |
| Phenol-red free DMEM | Sigma-Aldrich | D1145 | |
| counting Beads Count Bright | Life Technologies | C36950 | |
| PI | Miltenyi Biotec | 130-093-233 | |
| FcR Blocking Reagent | Miltenyi Biotec | 130-092-575 | |
| anti-CD31 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-097-418 | |
| anti-CD45 MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-052-301 | |
| Dead Cell Removal Kit | Miltenyi Biotec | 130-090-101 | |
| anti-Biotin MicroBeads | Miltenyi Biotec | 130-090-485 | |
| CD64 Purified | BioLegend | 139302 | Dilution: 1:100 |
| CD16/32 Purified | BioLegend | 101302 | Dilution: 1:100 |
| CD45 APC/Cy7 | BioLegend | 103116 | Dilution: 1:200, marks hematopoetic cells |
| CD31 Biotin | BioLegend | 102504 | Dilution: 1:200, marks endothelial cells |
| ASGPR1 Purified | Bio-Techne | AF2755-SP | Dilution: 1:100, marks hepatocytes |
| Podoplanin APC | BioLegend | 127410 | Dilution: 1:1400, marks progenior cells |
| Podoplanin Biotin | BioLegend | 127404 | Dilution: 1:1400 |
| CD133 PE | Miltenyi Biotec | 130-102-210 | use 3 µl, marks progenitor cells |
| CD133 Biotin | BioLegend | 141206 | Dilution: 1:100 |
| CD34 Biotin | eBioScience | 13-0341-81 | Dilution: 1:100 |
| CD90.2 Pacific Blue | BioLegend | 140306 | Dilution: 1:800 |
| CD157 PE | BioLegend | 140203 | Dilution: 1:600 |
| EpCAM Brilliant Violet 421 | BioLegend | 118225 | Dilution: 1:100 |
| Sca-1 Biotin | Miltenyi Biotec | 130-101-885 | use 10 µl |
| Mouse IgG2b, κ PE | BioLegend | 400311 | |
| Rat IgG1 PE | BioLegend | 400407 | |
| Rat IgG2b, κ APC/Cy7 | BioLegend | 400624 | |
| Rat IgG2a, κ Biotin | BioLegend | 400504 | |
| Rat IgG2a, κ Brilliant Violet 421 | BioLegend | 400535 | |
| Syrian Hamster IgG APC | BioLegend | 402012 | |
| Syrian Hamster IgG Biotin | BioLegend | 402004 | |
| Normal Goat IgG Control Purified | Bio-Techne | AB-108-C | |
| Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor 488 | Life Technologies | A11055 | Dilution: 1:800 |
| Streptavidin Alexa Fluor 405 | Life Technologies | S32351 | Dilution: 1:400 |
| 100 µm Filter mesh | A. Hartenstein | PAS3 | |
| LS Column | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |
| QuadroMACS separator | Miltenyi Biotec | 130-090-976 | |
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | 130-096-343 | |
| AutoMACS Pro Separator | Miltenyi Biotec | 130-092-545 | |
| FACS AriaTMIII | BD Biosciences | ||
| FACSDiva sofware | BD Biosciences | ||
| Polypropylene Round bottom tube | Falcon | 352063 | |
| Rneasy plus mini kit | Qiagen | 74134 | RLT lysis buffer is included |
Riferimenti
- Dolle, L., et al. Successful isolation of liver progenitor cells by aldehyde dehydrogenase activity in naive mice. Hepatology. 55 (2), 540-552 (2012).
- Dolle, L., et al. The quest for liver progenitor cells: a practical point of view. J Hepatol. 52 (1), 117-129 (2010).
- Dorrell, C., et al. Surface markers for the murine oval cell response. Hepatology. 48 (4), 1282-1291 (2008).
- Gouw, A. S., Clouston, A. D., Theise, N. D. Ductular reactions in human liver: diversity at the interface. Hepatology. 54 (5), 1853-1863 (2011).
- Tarlow, B. D., Finegold, M. J., Grompe, M. Clonal tracing of Sox9+ liver progenitors in mouse oval cell injury. Hepatology. 60 (1), 278-289 (2014).
- Shin, S., et al. Foxl1-Cre-marked adult hepatic progenitors have clonogenic and bilineage differentiation potential. Genes Dev. 25 (11), 1185-1192 (2011).
- Furuyama, K., et al. Continuous cell supply from a Sox9-expressing progenitor zone in adult liver, exocrine pancreas and intestine. Nat Genet. 43 (1), 34-41 (2011).
- Font-Burgada, J., et al. Hybrid Periportal Hepatocytes Regenerate the Injured Liver without Giving Rise to Cancer. Cell. 162 (4), 766-779 (2015).
- Kuramitsu, K., et al. Failure of fibrotic liver regeneration in mice is linked to a severe fibrogenic response driven by hepatic progenitor cell activation. Am J Pathol. 183 (1), 182-194 (2013).
- Pritchard, M. T., Nagy, L. E. Hepatic fibrosis is enhanced and accompanied by robust oval cell activation after chronic carbon tetrachloride administration to Egr-1-deficient mice. Am J Pathol. 176 (6), 2743-2752 (2010).
- Spee, B., et al. Characterisation of the liver progenitor cell niche in liver diseases: potential involvement of Wnt and Notch signalling. Gut. 59 (2), 247-257 (2010).
- Eckert, C., et al. Podoplanin discriminates distinct stromal cell populations and a novel progenitor subset in the liver. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 310 (1), G1-G12 (2016).
- Epting, C. L., et al. Stem cell antigen-1 is necessary for cell-cycle withdrawal and myoblast differentiation in C2C12 cells. J Cell Sci. 117 (Pt 25), 6185-6195 (2004).
- Tirnitz-Parker, J. E., Tonkin, J. N., Knight, B., Olynyk, J. K., Yeoh, G. C. Isolation, culture and immortalisation of hepatic oval cells from adult mice fed a choline-deficient, ethionine-supplemented diet. Int J Biochem Cell Biol. 39 (12), 2226-2239 (2007).
- Rountree, C. B., et al. A CD133-expressing murine liver oval cell population with bilineage potential. Stem Cells. 25 (10), 2419-2429 (2007).
- Rountree, C. B., Ding, W., Dang, H., Vankirk, C., Crooks, G. M. Isolation of CD133+ liver stem cells for clonal expansion. J Vis Exp. (56), (2011).
- Sidney, L. E., McIntosh, O. D., Hopkinson, A. Phenotypic Change and Induction of Cytokeratin Expression During In Vitro Culture of Corneal Stromal Cells. Invest Ophthalmol Vis Sci. 56 (12), 7225-7235 (2015).
- Hass, R., Kasper, C., Bohm, S., Jacobs, R. Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC. Cell Commun Signal. 9, 12 (2011).
- Schmelzer, E., et al. Human hepatic stem cells from fetal and postnatal donors. J Exp Med. 204 (8), 1973-1987 (2007).
