Вскрытие Личинки данио гонадная ткани
Summary
Здесь мы приводим протокол для выделения гонад ткани личиночного данио, что облегчит исследования данио половой дифференциации и обслуживание.
Abstract
Хотя дикие данио обладают / ZW определением пола ZZ, одомашненные данио потеряли половую хромосому. Они используют полигенную систему определения пола, где несколько генов, распределенных по всему геному совместно определяют половые тождества отдельных рыб. В настоящее время гены участвуют в регуляции развития гонад и как они работают остаются неуловимыми. Как правило, выделение гонадной ткани является первым шагом изучить половые процессы развития. Здесь мы представляем процедуру, чтобы изолировать гонады ткани от 17 дения (дней после оплодотворения) и 25 DPF данио личинок. Изолированная гонадная ткань может быть затем изучена с помощью морфологии и экспрессии генов профилирования.
Introduction
Основным фактором , определяющим женского пола в диком данио хромосоме 4 теряется или изменяется в одомашненных данио (например , общие штаммы лаборатории) 1. Вместо этого они имеют полигенную систему определения пола сопровождается экологическими факторами, такие как температура, гипоксия, наличие пищи и плотность населения. Детальные механизмы развития данио пола до конца не изучены. Фундаментальные вопросы , такие как , когда происходит данио определение пола, что основной сигнал определения пола (ы) является / являются, и какие гены регулируют первый шаг преобразования гонад остаются не заполнено 2, 3.
В процессе развития данио пола, несколько важных этапов были признаны. На ранней стадии развития, начиная с 4 часов после оплодотворения (ч после оплодотворения) эмбриональные-клетки (ПКА) претерпевают спецификации, переход к генитальному хребту ипролиферация. PGC число и взаимные взаимодействия между зародышевыми клетками и соматическими клетками имеют важное значение для дифференциации гонад 4. В 13 денье (дней после оплодотворения), гонады находятся в недифференцированной стадии. К 17 денье, гонады развиваются в два раза потенциальных яичников у обоих будущих самок и самцов. Апоптоз-зависимый переход от яичника к семеннику начинается с 21 до 25 дения и может продолжаться в течение нескольких недель. К 35 денье, пол гонады была определена и секс конкретного производства гамет ведется в обоих яичников и семенников 5, 6, 7.
На сегодняшний день, были предложены различные гены и механизмы определения пола кандидатов. Протеомика и анализ транскриптомного выделили множество генов с половым диморфизмом экспрессией и эти гены были использованы для изучения половой дифференциации в данио 8, </sup> 9, 10. Например, в личиночной данио, ген cyp19a1a специфически экспрессируется в яичниках , но не в семенниках 11, 12. Кроме того, ген АМГА слабо выражен в овариальных фолликулах зернистых клеток, но сильно в клетках Сертоли семенников 13. В противоположность этому , ген васа непрерывно выражается в зародышевых клетках как женского и мужского данио, что делает его подходящим маркером гонад 14, 15.
Исследование гонадных уровней экспрессии генов важно понять молекулярный механизм определения пола и дифференциации , особенно в би-потенциал яичников стадии 3, 9. Однако небольшой размер личиночной данио и, соответственно, мелких гонад осложнить изоляцию gonadaл ткани для дальнейшего молекулярного анализа. Предыдущие исследования использовали расчлененные весь регион магистрального между opercula и анальной порой 16. Этот препарат, хотя, содержащие гонады, состоит из нескольких тканей и органов. Альтернативно, трансгенные животные с выражением GFP гонад специфические , такие как Vasa: были использованы EGFP для изоляции гонадной ткани с помощью флуоресцентной активированной сортировки клеток (FACS) и лазерного захвата микро-рассечение 17, 18. Но их широкое применение ограничено. Здесь мы опишем простую процедуру, чтобы изолировать гонад ткани от личиночной данио в 17 денье и 25 денье. Мы демонстрируем позицию гонад по отношению к другим органам и изолировать морфологический интактные гонады от окружающих тканей. Мы также показываем , гонады специфических генов , такие как Vasa и cyp19a1a высоко выражены в изолированных гонадах по сравнению с магистральной тканью через количественный ПЦР (КПЦР) анализа. Настоящий протокол позволяет идентификации, выделения, очистки РНК и амплификации специфических генов гонад из личиночной данио, тем самым позволяя последующего молекулярного анализа гонадной ткани 19.
Protocol
Representative Results
Discussion
Данио стал мощной моделью и широко используется в разработках и исследовании заболеваний, связанные с. Методы выделения органов у взрослых данио , таких как мозг, сердце, гонады и почки, были хорошо документированы 23, 24, 25. Из-за небольшо…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим C Zhang для ухода рыбы. Эта работа была поддержана Национальным фондом естественных наук Китая (31171074, 31371099 и 31571067 ГПА) и Таланты проект Пуцзяна (09PJ1401900 по ГПУ).
Materials
| Cell culture dish 100 mm | Corning | 430167 | For embryo incubation |
| 20 X EM | For a 1 liter needed: add 17.5 g NaCl, 0.75 g KCl and 2.9 g CaCl.2H2O; then add 0.41 g KH2PO4, 0.412 g Na2HPO4 anhydrous and 4.9 g MgSO4. 7H2O. | ||
| 1 X EM | Dilute 20 X EM in distilled water | ||
| AGAROSE G-10 | Gene | 121985 | For preparing the 2% agar plates |
| Trizol Reagent | Invitrogen | 15596-026 | For RNA isolation |
| Meter glass | Shen Bo | 250 ml | For preparing the 2% agar plates |
| Microwave Oven | Midea | M1-211A | For heating the AGAR |
| TWEEZER DUMONT#5INOX | World Precision Instrument | 500341 | For dissection |
| Stereomicroscope | Motic | SMZ168 | For dissection |
| Pure water equipment | Millipore | ||
| Ringer’s solution | For a 1 liter needed: Add 6.78g NaCl, 0.22 g KCl, 0.26 g CaCl2 and 1.19 g Hepes; then fill to 1 L; Adjust pH to 7.2. Sterilize by filtration and keep in an autoclaved clear polycarbonate container. | ||
| Transfer pipette | Samco | 202, 204 | |
| Metal bath | QiLinbeier | Model GL-150 | |
| Microscope | Leica | M205 FA | For photomicrograph |
| Centrifuge | Eppendorf | 5417R | |
| Micro Scale RNA Isolation Kit | Ambion | AM1931 | For RNA isolation from gonad tissues |
| Dnase I | Sigma | AMPD1-1KT | For DNA digestion in the RNA solution |
| RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit | Thermo Scientific | #K1631 | For first-strand cDNA synthesis |
| Rnase H | Thermo Scientific | #EN0202 | For digesting the residual RNA in the cDNA solution. |
| SYBR Green Realtime PCR Master Mix | TOYOBO | QPK-201 | This product is a Taq DNA polymerase-based 2 x master mix for real-time PCR and applicable for intercalation assay with SYBR Green I. |
| Spectrophotometer | Ne Drop | OD-2000+ | Measuring the concentration of the total RNA |
| Mastercycler | Eppendorf | AG 22331 Hamburg | gene expression profiling |
Riferimenti
- Wilson, C. A., et al. Wild sex in zebrafish: loss of the natural sex determinant in domesticated strains. Genetica. 198 (3), 1291-1308 (2014).
- Liew, W. C., Orban, L. Zebrafish sex: a complicated affair. Genomics. 13 (2), 172-187 (2014).
- Orban, L., Sreenivasan, R., Olsson, P. Long and winding roads: Testis differentiation in zebrafish. Mol. Cell. Endocrinol. 312 (1-2), 35-41 (2009).
- Blaser, H., et al. Transition from non-motile behaviour to directed migration during early PGC development in zebrafish. J. Cell Sci. 118, 4027-4038 (2005).
- Wang, X. G., Orban, L. Anti-Müllerian hormone and 11 β-hydroxylase show reciprocal expression to that of aromatase in the transforming gonad of zebrafish males. Dev. Dynam. 236 (5), 1329-1338 (2007).
- Siegfried, K. R., Nüsslein-Volhard, C. Germ line control of female sex determination in zebrafish. Dev. Biol. 324 (2), 277-287 (2008).
- Uchida, D., Yamashita, M., Kitano, T., Iguchi, T. Oocyte apoptosis during the transition from ovary-like tissue to testes during sex differentiation of juvenile zebrafish. J. Exp. Biol. 205 (Pt 6), 711-718 (2002).
- Groh, K. J., Schönenberger, R., Eggen, R. I. L., Segner, H., Suter, M. J. F. Analysis of protein expression in zebrafish during gonad differentiation by targeted proteomics. Gen. Comp. Endocr. 193, 210-220 (2013).
- Siegfried, K. R. In search of determinants: gene expression during gonadal sex differentiation. J. Fish Biol. 76 (8), 1879-1902 (2010).
- Small, C. M., Carney, G. E., Mo, Q., Vannucci, M., Jones, A. G. A microarray analysis of sex- and gonad-biased gene expression in the zebrafish: evidence for masculinization of the transcriptome. BMC Genomics. 10, 579 (2009).
- Chiang, E. F., Yan, Y. L., Guiguen, Y., Postlethwait, J., Chung, B. Two Cyp19 (P450 aromatase) genes on duplicated zebrafish chromosomes are expressed in ovary or brain. Mol. Biol. Evol. 18 (4), 542-550 (2001).
- Kishida, M., Callard, G. V. Distinct cytochrome P450 aromatase isoforms in zebrafish (Danio rerio) brain and ovary are differentially programmed and estrogen regulated during early development. Endocrinology. 142 (2), 740-750 (2001).
- Rodríguez-Marí, A., et al. Characterization and expression pattern of zebrafish anti-Müllerian hormone (amh) relative to sox9a, sox9b, and cyp19a1a, during gonad development. Gene Expr.Patterns. 5 (5), 655-667 (2005).
- Krovel, A. V., Olsen, L. C. Expression of a vas::EGFP transgene in primordial germ cells of the zebrafish. Mech Dev. 116 (1-2), 141-150 (2002).
- Krovel, A. V., Olsen, L. C. Sexual dimorphic expression pattern of a splice variant of zebrafish vasa during gonadal development. Dev. Biol. 271 (1), 190-197 (2004).
- Tzung, K. W., et al. Early depletion of primordial germ cells in zebrafish promotes testis formation. Stem Cell Reports. 4 (1), 61-73 (2015).
- Hsiao, C., Tsai, H. Transgenic zebrafish with fluorescent germ cell: a useful tool to visualize germ cell proliferation and juvenile hermaphroditism in vivo. Dev. Biol. 262 (2), 313-323 (2003).
- Jorgensen, A., Nielsen, J. E., Morthorst, J. E., Bjerregaard, P., Leffers, H. Laser capture microdissection of gonads from juvenile zebrafish. Reprod Biol Endocrinol. 7, 97 (2009).
- Chen, S., Zhang, H., Wang, F., Zhang, W., Peng, G. nr0b1 (DAX1) mutation in zebrafish causes female-to-male sex reversal through abnormal gonadal proliferation and differentiation. Mol. Cell. Endocrinol. 433, 105-116 (2016).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book: A Guide for The Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Liew, W. C., et al. Polygenic sex determination system in zebrafish. PLoS One. 7 (4), e34397 (2012).
- Parichy, D. M., Elizondo, M. R., Mills, M. G., Gordon, T. N., Engeszer, R. E. Normal table of postembryonic zebrafish development: staging by externally visible anatomy of the living fish. Dev Dyn. 238 (12), 2975-3015 (2009).
- Gupta, T., Mullins, M. C. Dissection of Organs from the Adult Zebrafish. J. Vis Exp. (37), (2010).
- Arnaout, R., Reischauer, S., Stainier, D. Y. R. Recovery of Adult Zebrafish Hearts for High-throughput Applications. J. Vis Exp. (94), (2014).
- Gerlach, G. F., Schrader, L. N., Wingert, R. A. Dissection of the Adult Zebrafish Kidney. J. Vis Exp. (54), (2011).
- Yoon, C., Kawakami, K., Hopkins, N. Zebrafish vasa homologue RNA is localized to the cleavage planes of 2- and 4-cell-stage embryos and is expressed in the primordial germ cells. Development. 124 (16), 3157-3165 (1997).
- Braat, A. K., Speksnijder, J. E., Zivkovic, D. Germ line development in fishes. Int. J. Dev. Biol. 43 (7), 745-760 (1999).
- Huang, H. Y., Ketting, R. F. Isolation of zebrafish gonads for RNA isolation. Methods Mol Biol. 1093, 183-194 (2014).
