Biosensing potenziale del membrane del neurone del motore in embrioni di Zebrafish in tensione

Lorena Benedetti; Anna Ghilardi; Laura Prosperi; Maura Francolini; Luca Del Giacco

doi:10.3791/55297

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Articolo metodologico

Biosensing potenziale del membrane del neurone del motore in embrioni di Zebrafish in tensione

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DOI:

10.3791/55297

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26 giugno 2017

Lorena Benedetti¹^,²^,³ , Anna Ghilardi⁴ , Laura Prosperi⁴ , Maura Francolini^*¹ , Luca Del Giacco^*⁴

¹Department of Medical Biotechnology and Translational Medicine, Università degli Studi di Milano, ²Department of Neuroscience; Department of Cell Biology, Howard Hughes Medical Institute, Yale University School of Medicine, ³Program in Cellular Neuroscience, Neurodegeneration and Repair, Yale University School of Medicine, ⁴Department of BioSciences, Università degli Studi di Milano

^* These authors contributed equally

In questo articolo

Sommario

I protocolli qui descritti consentono lo studio delle proprietà elettriche delle cellule eccitabili nelle condizioni fisiologiche più non invasive impiegando embrioni di zebrafish in un sistema in vivo insieme a un indicatore di tensione geneticamente codificato (GEVI) basato sul trasferimento di energia per risonanza di fluorescenza (FRET) espresso selettivamente nel tipo di cellula di interesse.

Abstract

I protocolli qui descritti sono progettati per consentire ai ricercatori di studiare la comunicazione cellulare senza alterare l'integrità dell'ambiente in cui si trovano le cellule. In particolare, sono stati sviluppati per analizzare l'attività elettrica delle cellule eccitabili, come i neuroni spinali. In uno scenario del genere, è fondamentale preservare l'integrità della cellula spinale, ma è anche importante preservare l'anatomia e la forma fisiologica dei sistemi coinvolti. Infatti, la comprensione del modo in cui il sistema nervoso – e altri sistemi complessi – funziona deve basarsi su un approccio sistemico. Per questo motivo, l'embrione vivo di zebrafish è stato scelto come sistema modello e le variazioni di tensione della membrana del neurone spinale sono state valutate senza interferire con le condizioni fisiologiche degli embrioni.

Qui, viene descritto un approccio che combina l'impiego di embrioni di zebrafish con un biosensore basato su FRET. Gli embrioni di zebrafish sono caratterizzati da un sistema nervoso molto semplificato e sono particolarmente adatti per applicazioni di imaging grazie alla loro trasparenza, che consente l'impiego di indicatori di tensione basati sulla fluorescenza sulla membrana plasmatica durante lo sviluppo del zebrafish. La sinergia tra queste due componenti permette di analizzare l'attività elettrica delle cellule negli organismi viventi intatti, senza perturbare lo stato fisiologico. Infine, questo approccio non invasivo può coesistere con altre analisi (ad esempio, registrazioni di movimenti spontanei, come mostrato qui).

Introduzione

L' analisi di componenti sistemica in vivo consente agli scienziati di indagare sul comportamento cellulare in modo più affidabile. Ciò è particolarmente vero quando l'attività sotto controllo è fortemente influenzata dalle interazioni delle cellule cellulari (sia a contatto che a contatto non dipendente), come nel sistema nervoso, dove la tensione della membrana cambia la comunicazione tra le cellule eccitabili. La comprensione delle informazioni codificate da questi segnali elettrici è la chiave per comprendere il modo in cui il sistema nervoso funziona sia negli stati fisiologici che nelle malattie.

Per studia....