Biosensing Motor Neuron Membran Potential i Live Zebrafish Embryos
Summary
Protocols described here allow for the study of the electrical properties of excitable cells in the most non-invasive physiological conditions by employing zebrafish embryos in an in vivo system together with a fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based genetically encoded voltage indicator (GEVI) selectively expressed in the cell type of interest.
Abstract
The protocols described here are designed to allow researchers to study cell communication without altering the integrity of the environment in which the cells are located. Specifically, they have been developed to analyze the electrical activity of excitable cells, such as spinal neurons. In such a scenario, it is crucial to preserve the integrity of the spinal cell, but it is also important to preserve the anatomy and physiological shape of the systems involved. Indeed, the comprehension of the manner in which the nervous system-and other complex systems-works must be based on a systemic approach. For this reason, the live zebrafish embryo was chosen as a model system, and the spinal neuron membrane voltage changes were evaluated without interfering with the physiological conditions of the embryos.
Here, an approach combining the employment of zebrafish embryos with a FRET-based biosensor is described. Zebrafish embryos are characterized by a very simplified nervous system and are particularly suited for imaging applications thanks to their transparency, allowing for the employment of fluorescence-based voltage indicators at the plasma membrane during zebrafish development. The synergy between these two components makes it possible to analyze the electrical activity of the cells in intact living organisms, without perturbing the physiological state. Finally, this non-invasive approach can co-exist with other analyses (e.g., spontaneous movement recordings, as shown here).
Introduction
In vivo systemisk komponentanalys gör det möjligt för forskare att undersöka cellulärt beteende på det mest tillförlitliga sättet. Detta gäller särskilt när aktiviteten under granskning påverkas starkt av cellcellsinteraktioner (både kontakt- och kontaktfria), som i nervsystemet, där membranspänningsförändringar driver kommunikationen bland excitativa celler. Förståelsen av informationen som kodas av dessa elektriska signaler är nyckeln till att förstå hur nervsystemet arbetar i både fysiologiska och sjukdomstillstånd.
För att studera cellelektriska egenskaper i de mest icke-invasiva fysiologiska förhållandena har flera genetiskt kodade spänningsindikatorer nyligen utvecklats 1 . I motsats till tidigare generationer av optiska spänningssensorer (huvudsakligen spänningskänsliga färgämnen) 2 möjliggör GEVIs in vivo analyser av det intakta neurala systemet ochDeras uttryck kan begränsas till specifika celltyper eller populationer.
Zebrafish embryot är valet av in vivo "substrat" för att dra nytta av den stora potentialen som tillskrivs GEVIs. Tack vare sin optiska klarhet och det förenklade, men evolutionärt konserverade nervsystemet, möjliggör sebrafiskmodellen enkel identifiering och manipulation av varje cellulär komponent i ett nätverk. Anställningen av den FRET-baserade GEVI-sjöjungfrunen 3 ledde faktiskt till identifiering av pre-symptomatiska förändringar i spinalmotor-neuronbeteende i en zebrafiskmodell av amyotrofisk lateralskleros (ALS) 4 .
Följande in vivo- protokoll beskriver hur man övervakar de elektriska egenskaperna hos ryggmotoriska neuroner i intakta zebrafiskembryon som uttrycker sjöjungfru på ett neuronspecifik sätt. Dessutom demonstrerar det hur farmakologiskt inducerad chanGes i sådana elektriska egenskaper kan förknippas med förändringar i frekvensen av embryonala spontana spolar, den stereotypa motoraktiviteten som karakteriserar zebrafiskens rörelsebeteende vid mycket tidiga utvecklingsstadier.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollet som presenteras här möjliggjorde att vi undersökte sambandet mellan de elektriska egenskaperna hos zebrafiskens embryo-ryggmotoriska neuroner och det spontana samlingsbeteendet, den tidigaste stereotypa motoraktiviteten, som uppträder kring 17 hkf av embryonisk utveckling och varar fram till 24 hkf 10 .
Vårt tillvägagångssätt ger forskare ett verktyg för att studera neurala systemet av intakta embryon, vilket helt bevarar komplexiteten hos interak…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to thank Simona Rodighiero for her priceless support with the FRET imaging analysis.
Materials
| Low Melting Point Agarose | Sigma-Aldrich | A9414 |
| DMSO | Sigma-Aldrich | W387520 |
| Riluzole | Sigma-Aldrich | R116 |
| Pfu Ultra HQ DNA polymerase | Agilent Technologies – Stratagene Products Division | 600389 |
| T3 Universal primer | Sigma-Aldrich | |
| Wizard SV Gel and PCR Clean-Up system | Promega | A9280 |
| Universal SmaI primer | Eurofins | |
| StrataClone Mammalian Expression Vector System / pCMV-SC blunt vector | Agilent Technologies – Stratagene Products Division | 240228 |
| SmaI | New England Biolabs | R0141S |
| T4 DNA ligase | Promega | M1801 |
| SalI | New England Biolabs | R0138S |
| EcoRV | New England Biolabs | R0195S |
| 35 mm, glass-bottomed imaging dish | Ibidi | 81151 |
| forceps | Sigma-Aldrich | F6521 |
| Stereomicroscope | Leica Microsystems | M10 F |
| Digital camera | Leica Microsystems | DFC 310 FX |
| Leica Application Suite 4.7.1 software | Leica Microsystems | |
| QuickTime Player, v10.4 | Apple | |
| Confocal microscope (inverted) | Leica Microsystems | TCS SP5 |
| Microinjector | Eppendorf | Femtojet |
| ImageJ macro Biosensor_FRET | ||
| GraphPad Prism 6.0c | GraphPad Software, Inc |
Riferimenti
- Knöpfel, T., Gallero-Salas, Y., Song, C. Genetically encoded voltage indicators for large scale cortical imaging come of age. Curr Opin Chem Biol. 27, 75-83 (2015).
- Chemla, S., Chavane, F. Voltage-sensitive dye imaging: Technique review and models. J Physiol Paris. 104 (1-2), 40-50 (2010).
- Tsutsui, H., Karasawa, S., Okamura, Y., Miyawaki, A. Improving membrane voltage measurements using FRET with new fluorescent proteins. Nat Methods. 5 (8), 683-685 (2008).
- Benedetti, L., et al. INaP selective inhibition reverts precocious inter- and motorneurons hyperexcitability in the Sod1-G93R zebrafish ALS model. Sci Rep. 6, 24515 (2016).
- Pennati, R., et al. Morphological differences between larvae of the Ciona intestinalis species complex: hints for a valid taxonomic definition of distinct species. PLoS ONE. 10 (5), 0122879 (2015).
- Park, H. C., et al. Analysis of upstream elements in the HuC promoter leads to the establishment of transgenic zebrafish with fluorescent neurons. Dev Biol. 227 (2), 279-293 (2000).
- Yuan, S., Sun, Z. Microinjection of mRNA and morpholino antisense oligonucleotides in zebrafish embryos. J Vis Exp. (27), (2009).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), (2009).
- Drapeau, P., et al. Development of the locomotor network in zebrafish. Prog Neurobiol. 68 (2), 85-111 (2002).
- Brustein, E., et al. Steps during the development of the zebrafish locomotor network. J Physiol Paris. 97 (1), 77-86 (2003).
- Drapeau, P., Ali, D. W., Buss, R. R., Saint-Amant, L. In vivo recording from identifiable neurons of the locomotor network in the developing zebrafish. J Neurosci Methods. 88, 1-13 (1999).
- Kawakami, K. Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates. Genome Biol. 8, (2007).
- Sungmoo, L., et al. Imaging Membrane Potential with Two Types of Genetically Encoded Fluorescent Voltage Sensors. J Vis Exp. (108), e53566 (2016).
