Utilizzando colture di neurosfere primarie al primario dello studio Cilia

Issei S. Shimada; Hemant Badgandi; Bandarigoda N. Somatilaka; Saikat Mukhopadhyay

doi:10.3791/55315

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Articolo metodologico

Utilizzando colture di neurosfere primarie al primario dello studio Cilia

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DOI:

10.3791/55315

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14 aprile 2017

Issei S. Shimada¹ , Hemant Badgandi¹ , Bandarigoda N. Somatilaka¹ , Saikat Mukhopadhyay¹

¹Department of Cell Biology, University of Texas Southwestern Medical Center

In questo articolo

Sommario

Cilium principale è di fondamentale importanza nella proliferazione delle cellule progenitrici neurali, la differenziazione neuronale e la funzione neuronale adulta. Qui, si descrive un metodo per studiare ciliogenesis e il traffico di segnalazione proteine di cilia nelle cellule staminali / progenitrici neurali e neuroni differenziati utilizzando colture di neurosfere primarie.

Abstract

Il cilio primario è di fondamentale importanza per la proliferazione delle cellule staminali/progenitrici neurali e per la differenziazione neuronale durante la vita embrionale, postnatale e adulta. Inoltre, la maggior parte dei neuroni differenziati possiede ciglia primarie che ospitano recettori di segnalazione, come i recettori accoppiati a proteine G, e molecole di segnalazione, come le adenilil ciclasi. Il cilio primario determina l'attività di molteplici vie di sviluppo, tra cui la via del riccio sonico durante lo sviluppo neuronale embrionale, e funziona anche nel promuovere la segnalazione subcellulare compartimentalizzata durante la funzione neuronale adulta. Non sorprende che i difetti nella biogenesi e nella funzione del cilio primario siano stati collegati ad anomalie dello sviluppo del cervello, obesità centrale e deficit di apprendimento e memoria. Pertanto, è imperativo studiare la biogenesi del cilio primario e il traffico ciliare nel contesto delle cellule staminali/progenitrici neurali e dei neuroni differenziati. Tuttavia, i metodi di coltura per i neuroni primari richiedono una notevole esperienza e non sono suscettibili di cicli di congelamento-scongelamento. In questo protocollo, discutiamo i metodi di coltura per popolazioni miste di cellule staminali/progenitrici neurali utilizzando neurosfere primarie. I metodi di coltura basati sulla neurosfera offrono i vantaggi combinati dello studio delle cellule staminali/progenitrici neurali primarie: adattabilità a passaggi multipli e cicli di congelamento-scongelamento, potenziale di differenziazione in neuroni/glia e trasfettibilità. È importante sottolineare che abbiamo determinato che le cellule staminali/progenitrici neurali derivate dalla neurosfera e i neuroni differenziati sono ciliati in coltura e localizzano molecole di segnalazione rilevanti per la funzione ciliare in questi compartimenti. Utilizzando queste colture, descriviamo ulteriormente i metodi per studiare la ciliogenesi e il traffico ciliare nelle cellule staminali/progenitrici neurali e nei neuroni differenziati. Questi metodi basati sulla neurosfera ci consentono di studiare i percorsi cellulari regolati dalle ciglia, tra cui il recettore accoppiato a proteine G e la segnalazione del riccio sonico, nel contesto delle cellule staminali/progenitrici neurali e dei neuroni differenziati.

Introduzione

Cilio primario è un compartimento subcellulare dinamica microtubuli-based che funziona come antenna sensoriale nel coordinare percorsi di segnalazione cellulare, tra cui la via di Sonic Hedgehog (Shh) durante lo sviluppo embrionale neuronale ^{^1,} ^2, e compartimentato segnalazione subcellulare nell'adulto funzione neuronale ^{^3,} ⁴ . Segnalazione componenti di queste vie, come il recettore Patched Shh ^5; la via attivatore Smoothened (SMO) ^6; e Gpr161 ^7, un recettore orfano accoppiat....