Aviaire-sperma door cloaca Massage en isolatie van DNA van sperma
Summary
Dit protocol beschrijft cloaca massage, een niet-invasieve handmatige techniek voor het verzamelen van sperma van vogels, en DNA-extractie van aviaire-sperma met behulp van een commerciële winning kit met wijzigingen.
Abstract
Van sperma kan nuttig zijn voor een breed scala aan toepassingen waaronder studies waarbij kwaliteit van het sperma, sperma telomeer dynamiek en epigenetica. Vogels zijn gebruikte onderwerpen in biologisch onderzoek en zijn ideaal voor studies waarbij herhaalde spermastaaltje. Er zijn echter weinig middelen momenteel beschikbaar voor diegenen die willen leren hoe te verzamelen en DNA halen uit aviaire-sperma. Hier beschrijven we cloaca massage, een zachte, niet-invasieve handmatige techniek voor het verzamelen van aviaire-sperma. Hoewel deze techniek is gevestigd in de literatuur, kan het moeilijk zijn om te leren van de beschrijvingen van de beschikbare. We bieden ook informatie voor de extractie van DNA van aviaire-sperma met behulp van een commerciële winning kit met wijzigingen. Cloaca massage kan gemakkelijk worden gebruikt op elke kleine tot middelgrote mannelijke zangvogels reproductieve voorwaarde. Na collectie, het sperma kan worden onmiddellijk gebruikt voor beweeglijkheid testen of bevroren voor DNA-extractie volgens het protocol hierin beschreven. Dit extractie-protocol werd verfijnd voor aviaire-sperma en met succes heeft geweest tweedehands voort monsters verzameld uit verschillende uit de orde zangvogels soorten (Passer domesticus, Spizella passerina Haemorhous mexicanusen Turdus migratorius ) en een columbid (Columba livia).
Introduction
Vogels zijn ideale onderwerpen voor studies waarbij kwaliteit van het sperma en competitie1, sperma telomeer dynamics2epigenetica3en soortgelijke onderwerpen, zoals ze veel in biologisch onderzoek gebruikt worden en sperma kan gemakkelijk worden bemonsterd met behulp van cloaca Massage. Cloaca massage is een zachte, niet-invasieve handmatige techniek voor het verzamelen van sperma van vogels4,5,6. Herhaalde monsters kunnen gemakkelijk worden verkregen en geen speciaal gereedschap nodig, waardoor het eenvoudig uit te voeren in het veld of het lab zijn. Hoewel cloaca massage al decennialang gebruikt, is het moeilijk om te leren van de beschikbare geschreven beschrijvingen. Deze publicatie is bedoeld om de tijd en de onzekerheid die betrokken zijn bij het leren van de cloaca massage.
Sperma van dieren met behulp van cloaca massage kan worden onmiddellijk gebruikt voor motiliteit beoordeling4,7 of8van de kunstmatige inseminatie, of bevroren voor andere toepassingen zoals geavanceerde imaging en DNA-extractie. Sperma monsters van zangvogels zijn klein maar bevatten dichtbevolkte vol sperma. DNA wordt geëxtraheerd met behulp van een commerciële winning kit voor eenvoud, met wijzigingen aan het overwinnen van de speciale beschermende functies van sperma9. Na extractie, kunnen sperma telomeren worden gemeten met behulp van qPCR10.
Protocol
Representative Results
Discussion
Beschrijven we een eenvoudige en betrouwbare methode voor het verzamelen van sperma van kleine en middelgrote zangvogels reproductief actieve toestand en extractie van DNA van aviaire-sperma.
Het protocol van de extractie van het DNA van omschreven sperma is aangepast ten opzichte van een kit voor eenvoud, maar werd verfijnd voor gebruik op aviaire-sperma. Sperma resistent zijn tegen lysis door standaard extractie chemicaliën9,13, en …
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Wij danken Jose Noguera voor vroege hulp bij cloaca massage, en Jeffrey Kittilson voor lab ondersteunen. Dit werk werd gesteund door een award ND EPSCoR FAR0022429 te BJH. Publicatiekosten waren genereus ondersteund door de NDSU afdeling biologische wetenschappen.
Materials
| Microhematocrit capillary tubes | Fisherbrand | 22-362566 | Any supplier can be used. Smaller tubes may be more effective for collection of small semen samples, such as from very small passerine birds like chipping sparrow. |
| Microcentrifuge tubes | Any | ||
| 1x PBS | Any | Used for storing semen samples prior to DNA extraction. | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D0632 | |
| Tris base | Sigma-Aldrich | 10708976001 | Any supplier can be used. |
| EDTA | Sigma-Aldrich | 1233508 | Any supplier can be used. |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 793566 | Any supplier can be used. |
| SDS | Sigma-Aldrich | 1614363 | Any supplier can be used. |
| QIAamp DNA micro kit | Qiagen | 56304 | Qiagen QIAamp DNA micro kit is recommended specifically. This DNA extraction protocol has been attempted with other commercial kits but with little success. The reasons for this are unknown to us. |
Riferimenti
- Briskie, J. V., Montgomerie, R. Sperm size and sperm competition in birds. Proc. R. Soc. B. 247, 89-95 (1992).
- Monaghan, P. Telomeres and life histories: the long and the short of it. Ann. N.Y. Acad. Sci. 1206, 130-142 (2010).
- Carrell, D. T. Epigenetics of the male gamete. Fertility and Sterility. 97 (2), 267-274 (2012).
- Burrows, W. H., Quinn, J. P. The collection of spermatozoa from the domestic fowl and turkey. Poultry Science. 16 (1), 19-24 (1937).
- Wolfson, A. The cloacal protuberance: a means for determining breeding condition in live male birds. Bird-Banding. 23 (4), 159-165 (1952).
- Kast, T. L., Ketterson, E. D., Nolan, V. Variation in ejaculate quality in dark-eyed juncos according to season, stage of reproduction, and testosterone treatment. The Auk. 115 (3), 684-693 (1998).
- Helfenstein, F., Podevin, M., Richner, H. Sperm morphology, swimming velocity, and longevity in the house sparrow Passer domesticus. Behav. Ecol. Sociobiol. 64, 557-565 (2010).
- Purchase, C. F., Earle, P. T. Modifications to the IMAGEJ computer assisted sperm analysis plugin greatly improve efficiency and fundamentally alter the scope of attainable data. J. Appl. Icthyol. 28, 1013-1016 (2012).
- Gill, P., Jeffreys, A. J., Werrett, D. J. Forensic application of DNA ‘fingerprints’. Nature. 318 (12), 577-579 (1985).
- Criscuolo, F., et al. Real-time quantitative PCR assay for measurement of avian telomeres. J. Avian Biol. 40, 342-347 (2009).
- Lovette, I. J., Fitzpatrick, J. W. . Cornell Lab of Ornithology Handbook of Bird Biology, 3rd Edition. , (2016).
- . . QIAamp DNA Micro Handbook. , (2014).
- Carter, K. L., Robertson, B. C., Kempenaers, B. A differential DNA extraction method for sperm on the perivitelline membrane of avian eggs. Mol. Ecol. 9, 2149-2154 (2000).
- Birkhead, T. R., Buchanan, K. L., Devoogd, T. J., Pellatt, E. J., Catchpole, C. K. Song, sperm quality and testes asymmetry in the sedge warbler. Anim. Behav. 53, 965-971 (1997).
- Lüpold, S., Calhim, S., Immler, S., Birkhead, T. R. Sperm morphology and sperm velocity in passerine birds. Proc. R. Soc. B. 276, 1175-1181 (2009).
- Samour, J. H., Smith, C. A., Moore, H. D., Markham, J. A. Semen collection and spermatozoa characteristics in budgerigars (Melopsittacus undulates). Vet. Rec. 118, 397-399 (1986).
- Stelzer, G., Crosta, L., Bürkle, M., Krautwalt-Junghanns, M. E. Attempted semen collection using the massage technique and semen analysis in various psittacine species. J. Avian Med. Surg. 19 (1), 7-13 (2005).
