جيل من الإنشطار بروتين فلوري في<em> المبيضات</em> الأنواع
Summary
تعديل الجينات بوساطة PCR-يمكن استخدامها لتوليد اندماج بروتين فلوري في أنواع المبيضات، مما يسهل التصور والكميات من خلايا الخميرة والبروتينات. هنا، نقدم استراتيجية لبناء البروتين الانصهار فلوري (Eno1-FP) في المبيضات المرطية.
Abstract
المبيضات، المستعمرون السائد في مساحات والأمعاء والجهاز البولي التناسلي، هي سبب معظم الأمراض الفطرية الغازية في البشر. وبالتالي، هناك حاجة إلى أدوات الجزيئية والجينية لتسهيل دراسة الآليات المرضية الخاصة بهم. تعديل الجينات بوساطة PCR-هو نهج واضحة وسريعة لتوليد البروتينات الموسومة حاتمة لتسهيل الكشف عنها. على وجه الخصوص، البروتين الفلوري (FP) اندماج هي أدوات قوية التي تسمح التصور والكميات من كل من خلايا الخميرة والبروتينات بواسطة المجهر مضان وimmunoblotting، على التوالي. البلازميدات تحتوي FP تسلسل الترميز، جنبا إلى جنب مع الجينات علامة الغذائية التي تسهل التحول من المبيضات، تم إنشاؤها لغرض بناء FP والتعبير في المبيضات. هنا، نقدم استراتيجية لبناء الانصهار FP في المبيضات. البلازميدات التي تحتوي على المقاومة nourseothricinالامتحانات التنافسية الوطنية الجينات التحول علامة (NAT1) جنبا إلى جنب مع تسلسل إما أخضر، أصفر، أو الكرز ضباط الإتصال (GFP، YFP، mCherry) تستخدم جنبا إلى جنب مع الاشعال التي تشمل تسلسل الجينات المحددة في تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) لإنشاء كاسيت FP . هذا كاسيت جين معين لديه القدرة على الاندماج في نهاية 3'من مكان الجين المقابل عبر إعادة التركيب مثلي. يتم التحقق من نجاح الانصهار في إطار تسلسل FP في موضع الجينات في المصالح وراثيا، تليها تحليل التعبير انصهار بروتين بواسطة المجهر و / أو الطرق المناعية الكشف. وبالإضافة إلى ذلك، لحالة من البروتينات أعرب للغاية، اندماج ناجحة يمكن فرزهم لفي المقام الأول من خلال تقنيات التصوير مضان.
Introduction
المبيضات والفطريات المتعايشة التي تستعمر مساحات المعوية والجهاز البولي التناسلي من كل البشر. في ظل ظروف من نقص المناعة، مثل التي تحدث مع الولادة المبكرة أو الآثار المثبطة للمناعة من العلاجات لمرض السرطان، فهناك أنواع المبيضات تصبح مسببات الأمراض الانتهازية. من المبيضات، المبيضات البيض هو المستعمر الفطرية الأكثر انتشارا ويتسبب في غالبية الإصابات الفطرية الغازية. الأنواع الأخرى المبيضات مثل C. الجرداء، C. المرطية، C. مداري، وجيم kruseii يسبب أيضا التهابات خطيرة في المرضى الذين يعانون من نقص المناعة، مع بعض واظهار المقاومة الجوهرية ليشيع استخدامها المضادات الحيوية المضادة للفطريات مثل فلوكونازول وأمفوتيريسين B. ومن هنا، يتم مراقبتها العدوى مع بعض من هذه الأنواع أكثر في كثير من الأحيان، وخاصة في المرضى الذين يعالجون قائي مع الأدوية المضادة للفطريات. حتى مع وجود المناسب وفي الوقت المناسبالعلاج المعهد القومي للاتصالات للفطريات، تواصل انتانات المبيضات الغازية لتترافق مع معدلات الاعتلال والوفيات 1 كبير. ونظرا لأهمية المبيضات في صحة الإنسان، وهناك حاجة إلى أدوات الجزيئية متوفرة التي تسمح للدراسة وتوضيح آليات المرضية الخاصة بهم.
واحد أداة هامة تسمح للباحثين لتصور وتحديد الخلايا الميكروبية والبروتينات التي يتم التعبير هي FP تكنولوجيا الانصهار. تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) تعديل الجينات بوساطة، كما هو موضح في هذه الورقة، يسمح للبناء اندماج بين متواليات FP والبروتين المبيضات الترميز سلسلة من الفائدة في موضع لالجيني. التكامل مستقر للبناء يسهل تحليل تعبير البروتين وكذلك ديناميات البروتين التعريب. البلازميدات تحتوي على تسلسل FP، الأمثل للتعبير في المبيضات البيض والتي يمكن استخدامها في غرام بوساطة PCR-استراتيجية تعديل إيني، وقد تم بناؤها من قبل 2، 3، 4، 5. البلازميدات تحتوي FP التحول "الكاسيت": سلسلة FP ترتبط الجينات علامة الغذائية التي تسهل التحول من C. المبيضة البيضاء وجيم المرطية 2، 3، 4، 5، 6، 7. حاليا البلازميدات المتاحة تحتوي على مجموعة متنوعة من الجينات اختيار الغذائية علامة (URA3، HIS1، ARG4) للتحول من سلالات بعامل نمائي فضلا عن المهيمنة مقاومة المخدرات علامة (NAT1)، مما يسهل التحول من سلالات السريرية التي تفتقر إلى auxotrophies. وبالإضافة إلى ذلك، البلازميدات تحتوي على خيارات لمدة تصل إلى أربع سلاسل FP مختلفة (الأخضر [GFP]، الاصفرث [YFP]، السماوي [CFP]، والكرز [mCherry]) وإما تسلسل إنهاء ADH1 لبناء اندماج بروتين كربوكسي المحطة، أو تسلسل المروج لبناء اندماج البروتين الأمينية النهاية. صممت الاشعال تناظر مع لDNA البلازميد المحيطة كاسيت FP. وبالإضافة إلى ذلك، يحتوي الاشعال أيضا تسلسل 5'تمديد تحمل التماثل إلى الجينات الخميرة التي تهم أن المعلمة، مما يسهل دمج الكاسيت في موضع الجيني عبر إعادة التركيب مثلي (الشكل 1). يتم إنشاء أشرطة FP-جين معين من قبل PCR ثم تتحول إلى خلايا المبيضات جعلت المختصة لامتصاص الحمض النووي عن طريق العلاج مع خلات الليثيوم.
الشكل 1: رسم بياني لكيفية يتم إنشاؤها FP تسلسل اندماج في المبيضات. (A) امب البلازميد الحمض النوويوفاق سلسلة FP والترميز تسلسل nourseothricin المقاومة (NAT1). وتظهر المواقع النسبية للأمام (FWD) وعكس (REV) الاشعال، مع الأجزاء السوداء من الاشعال تشير إلى منطقة تناظر إلى التسلسل البلازميد والأجزاء الأرجواني تدل على المنطقة تماثل الجينات المحددة أو تمديد التمهيدي. يتم تحويل أشرطة (ب) FP إلى المبيضات والاندماج داخل ENO1 موضع الجيني عبر إعادة التركيب مثلي (الخطوط المنقطة). (C) مما أدى FP تسلسل الانصهار في 3'end من ENO1. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
هنا، نقدم مثالا للانصهار بروتين (Eno1-FP) الإنشاءات في المبيضات. نحن نستخدم علامات البلازميدات تحتوي على الجين NAT1 التحول علامة جنبا إلى جنب مع تسلسل ترميز GFP، YFP، أوmCherry (الشكل 2). وتستخدم هذه البلازميدات جنبا إلى جنب مع الاشعال في PCR لتوليد أشرطة الجينات المحددة التي تسهل اندماج ضباط الإتصال إلى نهاية 3'من ENO1، مما أدى إلى التعبير عن Eno1 تنصهر لضباط الإتصال في دورته كربوكسي-محطة.
الشكل 2: خرائط FP البلازميدات التي تحتوي على شريط كاسيت. يشار إلى الأمام (F) وعكس الاشعال (R) المستخدمة لتوليد أشرطة من البلازميدات جنبا إلى جنب مع الموقع النسبي للتناظر لالبلازميدات. تسلسل التمهيدي هي على النحو المبين في الجدول 1. استخدمت F1 و R1 أيضا لتوليد الكاسيت pYFP- NAT1. البلازميد التي تحتوي على كاسيت YFP- NAT1 (pMG2263) مطابق لpMG2120 باستثناء YFP في مكان تسلسل GFP. أحجام الكاسيت: GFP-NAT1، 3.7 KBP. mCherry- NAT1، 3.2 KBP. YFP- NAT1، 3.7 KBP. تم تعديل هذا الرقم من جيرامي نجاد، وآخرون. 4 الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Protocol
Representative Results
Discussion
بناء حاتمة الموسومة تسلسل في المبيضات باستخدام استراتيجية تعديل الجينات بوساطة PCR-المذكورة أعلاه يمكن تلخيصها على النحو عملية من ثلاث خطوات. أولا، يتم إجراء كاسيت من قبل PCR الذي يشفر كل من التسلسل المطلوب لتحقيق التكامل والمناطق مثلي إلى موضع الإدراج في الجينوم…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر N. عميد لتوفير الأصلي تسلسل mCherry FP، M. جيرامي نجاد لبناء البلازميدات، B. لارسون لتقديم المساعدة التقنية، وT. Heisel للحصول على المشورة المفيدة خلال تطوير هذا المشروع. وأيد JB من قبل جائزة الأوروبي مجلس البحوث المتقدمة 340087 (RAPLODAPT). وقدمت أنظمة المجهر والتصوير من جامعة مينيسوتا مؤسسة طب الأطفال ومركز جامعة التصوير ولاية مينيسوتا.
Materials
| 100W mercury lamp | CHIU Technical Corporation | M-100T | |
| 95% Ethanol | Any | NA | |
| Adenine | Any | NA | |
| Ampicillin | Any | NA | |
| Carrier DNA | Ambion | AM9680 | Sheared Salmon Sperm DNA 10 mg/ml |
| CCD Camera | Photometrics | CoolSNAP HQ | |
| Conical Tube | Corning | 430828 | 50ml |
| Culture Tube Rotator | New Brunswick | 2013923 | TC-8, or Any Culture Tube Rotator |
| Deoxynucleotides (dNTP) PCR Grade | Any | NA | |
| Eppendorf Tubes | Eppendorf | 022363719, 022363212 | 0.5ml, 1.5ml |
| Erlenmeyer Flask | Fisher Scientific | 7250089 | 125ml |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | Any | NA | |
| Freezer (-80 °C ) | Thermo Electron Corporation | ULT-1386-9-V | Revco Ultima II |
| GFP, YFP and Texas Red Filter Sets | Chroma Technology Corporation | 49002, 86004v2, 49008 | |
| Glass culture tubes | Fisher Scientific | 1496126 | 75mm |
| HRP goat anti-mouse antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-2005 | |
| HRP goat anti-rabbit antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-2301 | |
| Incubator (30 °C ) | Any | NA | |
| Lithium Acetate | Any | NA | |
| Lysogeny Broth (LB) Media | Any | NA | |
| Magnesium Chloride | Any | NA | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415 D | |
| Microscope | Nikon | E600 | Nikon Eclipse E600 |
| Microscope Image Analysis Software | Universal Imaging Corporation | 6.3r7 | MetaMorph Software Series 6.3r7 |
| Mouse anti-GFP antibody | Roche | 11814460001 | |
| Nourseothricin | Fisher Scientific | 50997939 | |
| PCR Thermocycler | Applied Biosystems | 9700 | GeneAmp PCR System |
| PCR tubes | BioExpress, GeneMate | T-3035-1 | 0.2ml |
| Polyethylene Glycol 3350 | Any | NA | |
| Potassium Chloride | Any | NA | |
| Rabbit anti-mCherry antibody | BioVision | 5993-100 | |
| Refrigerator (4°C) | Any | NA | |
| Sodium Acetate | Any | NA | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1500 | |
| Table Top Centrifuge | Labnet | Z 400 | Hermle Z 400 |
| Taq DNA Polymerase | Any | NA | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Any | NA | |
| Vortex Mixer | Scientific Industries | SI-0236 | Vortex Genie 2 |
| Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD) Media | Any | NA |
Riferimenti
- Bendel, C. M. Colonization and epithelial adhesion in the pathogenesis of neonatal candidiasis. Semin. Perinatol. 27 (5), 357-364 (2003).
- Gerami-Nejad, M., Berman, J., Gale, C. A. Cassettes for PCR-mediated construction of green, yellow, and cyan fluorescent protein fusions in Candida albicans. Yeast. 18 (9), 859-864 (2001).
- Gerami-Nejad, M., Dulmage, K., Berman, J. Additional cassettes for epitope and fluorescent fusion proteins in Candida albicans. Yeast. 26 (7), 399-406 (2009).
- Gerami-Nejad, M., Forche, A., McClellan, M., Berman, J. Analysis of protein function in clinical C. albicans isolates. Yeast. 29 (8), 303-309 (2012).
- Gerami-Nejad, M., Hausauer, D., McClellan, M., Berman, J., Gale, C. Cassettes for the PCR-mediated construction of regulatable alleles in Candida albicans. Yeast. 21 (5), 429-436 (2004).
- Gonia, S., Larson, B., Gale, C. A. PCR-mediated gene modification strategy for construction of fluorescent protein fusions in Candida parapsilosis. Yeast. 33 (2), 63-69 (2016).
- Milne, S. W., Cheetham, J., Lloyd, D., Aves, S., Bates, S. Cassettes for PCR- mediated gene tagging in Candida albicans utilizing nourseothricin resistance. Yeast. 28 (12), 833-841 (2011).
- Ausubel, F. M., et al. . Current Protocols in Molecular Biology. , (1995).
- Wilson, R. B., Davis, D., Mitchell, A. P. Rapid hypothesis testing with Candida albicans through gene disruption with short homology regions. J. Bacteriol. 181 (6), 1868-1874 (1999).
- Pulver, R., et al. Rsr1 focuses Cdc42 activity at hyphal tips and promotes maintenance of hyphal development in Candida albicans. Eukaryotic Cell. 12 (4), 482-495 (2013).
- Falgier, C., et al. Candida species differ in their interactions with immature human gastrointestinal epithelial cells. Pediatr. Res. 69 (5), 384-389 (2011).
- Nosek, J., et al. Genetic manipulation of the pathogenic yeast Candida parapsilosis. Curr. Genet. 42 (1), 27-35 (2002).
- Zemanova, J., Nosek, J., Tomaska, L. High-efficiency transformation of the pathogenic yeast Candida parapsilosis. Curr. Genet. 45 (3), 183-186 (2004).
- Benjamin, D. K., et al. Neonatal candidiasis among extremely low birth weight infants: risk factors, mortality rates, and neurodevelopmental outcomes at 18 to 22 months. Pediatrics. 117 (1), 84-92 (2006).
- Kullberg, B. J., Arendrup, M. C. Invasive Candidiasis. N Engl J Med. 373 (15), 1445-1456 (2015).
