PCR בתיווך שינוי גנטי יכול לשמש כדי ליצור תערובות חלבון פלואורסצנטי במיני קנדידה, המאפשר הדמיה לכמת בתאי שמרים וחלבונים. בזאת, אנו מציגים אסטרטגיה לבניית שילוב חלבון פלואורסצנטי (Eno1-FP) ב קנדידה parapsilosis.
מיני קנדידה, הקולוניאליסטים רווחים של קטעי מעיים ו מין ושתן, הן הגורם של רוב הזיהומים פטרייתיים פולשניים בבני אדם. לכן, כלים מולקולריים וגנטיים נדרשים כדי להקל על המחקר של המנגנונים בפתוגנזה שלהם. PCR בתיווך שינוי גנטי הוא גישה פשוטה ומהירה ליצור חלבונים מתויג epitope כדי להקל הגילוי שלהן. בפרט, חלבון פלואורסצנטי (FP) התכה הם כלים רבי עוצמה המאפשרים הדמיה לכמת הן בתאי שמרים וחלבונים על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי ו immunoblotting, בהתאמה. פלסמידים המכילים רצפי קידוד FP, יחד עם גני סמן תזונתיים המסייעים טרנספורמציה של מיני קנדידה, נוצרו לצורך בניית הביטוי FP ב קנדידה. בזאת, אנו מציגים אסטרטגיה לבניית היתוך FP בתוך מיני קנדידה. פלסמידים המכילים את עמיד nourseothricinגן סמן טרנספורמציה NCE (NAT1) וכן רצפים לאף ירוק, צהוב, או דובדבן FPS (GFP, YFP, mCherry) משמש יחד עם פריימרים הכוללים רצפים ספציפי גני תגובת שרשרת פולימראז (PCR) כדי ליצור קלטת FP . יש קלטת גן ספציפי זה יש את היכולת להשתלב סוף 3'של מוקד הגן המקביל באמצעות רקומבינציה הומולוגיים. היתוך בתוך המסגרת מוצלחת של רצף FP לתוך מוקד הגן של עניין מאומת גנטי, ואחריו ניתוח של ביטוי חלבון היתוך על ידי מיקרוסקופ ו / או שיטות איתור חיסוני. בנוסף, במקרה של חלבונים מבוטאים בכמות גבוהה, יכולים להיות מוקרנים בשילובים מוצלחים בעיקר על ידי שיטות הדמית קרינה.
מיני קנדידה הם פטריות commensal כי ליישב את שטחי מעי מין ושתן של כל בני האדם. בתנאים של כשל חיסוני, כגון המתרחשות עם לידה מוקדמת או תופעות מדכאות חיסון מן הטיפולים בסרטן, מיני הקנדידה יכולים להיות פתוגנים אופורטוניסטים. של מיני קנדידה, קנדידה אלביקנס הקולוניאליסט פטרייתי הנפוץ ביותר וגורם רוב הזיהומים פטרייתיים פולשניים. מינים אחרים קנדידה כגון ג glabrata, ג parapsilosis, tropicalis ג, ו- C. kruseii גם לגרום לזיהומים רציניים בחולים מדוכאי חיסון, עם קצת התנגדות פנימית מפגין נפוצים אנטיביוטיקה אנטי פטרייתי כגון fluconazole ו amphotericin B. לפיכך, זיהומים עם כמה מינים אלה הנצפים בתדירות גבוהה יותר, במיוחד בקרב חולי המטופלים מניעתי עם תרופות אנטי פטרייתי. אפילו עם הולם במועדNTI-פטרייתי לטיפול, זיהומי קנדידה פולשניים להמשיך להיות מזוהה עם תחלואה משמעותית ותמותה 1. בגלל המשמעות של מינים הקנדידה לבריאות האדם, יש צורך בכלים מולקולריים זמינים המאפשרים לימוד ובירור מהותה של מנגנוני בפתוגנזה שלהם.
כלי אחד חשוב המאפשר לחוקרים לחזות ולכמת תאים מיקרוביאליים החלבונים שהם מביעים היא טכנולוגיית היתוך FP. תגובת שרשרת פולימראז (PCR) שינוי גנטי בתיווך, כמתואר במאמר זה, מאפשרת בנייה של התכה, בין רצפי FP לבין חלבון קנדידה קידוד רצף של ריבית מוקד הגנומי שלו. שילוב יציב של המבנה מאפשר ניתוח של ביטוי חלבון כמו גם דינמיקת לוקליזציה חלבון. פלסמידים המכילים רצפי FP, אופטימיזציה עבור ביטוי קנדידה אלביקנס וכי ניתן להשתמש ב- G בתיווך PCRאנרגית אסטרטגית שינוי, נבנתה בעבר 2, 3, 4, 5. פלסמידים המכילים FP טרנספורמציה "קלטות": רצף FP צמוד גן סמן תזונתי המאפשר השינוי של ג אלביקנס ו- C. parapsilosis 2, 3, 4, 5, 6, 7. נכון לעכשיו פלסמידים זמינים כוללים מגוון של גני סמן תזונתיים לבחירה (URA3, HIS1, ARG4) לחידוש זני auxotrophic גם כסמן עמידות לתרופות דומיננטיות (NAT1), המאפשר שינוי של זנים קליניים חסרי auxotrophies. בנוסף, פלסמידים המכילים אפשרויות עבור עד ארבעה רצפים FP שונים (ירוק [GFP], Yellow [YFP], ציאן [CFP], ודובדבן [mCherry]) ואו רצף סיום ADH1 לבנייה של התכה חלבון carboxy הסופית-, או רצף האמרגן לבנייה של התכה חלבון אמינו הסופית-. Primers נועדו עם הומולוגיה ל- DNA פלסמיד סביב קלטת FP. בנוסף, פריימרים גם כוללים סדרות 5'-רחבת נושאות הומולוגיה לגן שמרי עניין להיות מתויג, המאפשר אינטגרציה של הקלטת לתוך מוקד גנומית באמצעות רקומבינציה הומולוגי (איור 1). גן ספציפי קלטות FP מופקות על ידי PCR ואז להפוך לתאי קנדידה עשו מוסמכת לספיגה של ה- DNA על ידי טיפול עם אצטט ליתיום.
איור 1: תרשים של איך בשילובי רצף FP נוצרים מיני קנדידה. (א) includ DNA פלסמידes רצף FP וכן קידוד רצף nourseothricin התנגדות (NAT1). מיקומים יחסיים של קדימה (FWD) primers ההפוכה (REV) נראים לעין, עם חלקים שחורים של פריימרים המציינים באזור של הומולוגיה לרצף פלסמיד ואת המנות הסגולות המציינות באזור הומולוגית הגן ספציפי או הארכה יחל. (B) קלטות FP הופכות קנדידה ולשלב בתוך מוקד גנומית ENO1 באמצעות רקומבינציה הומולוגי (קווים מקווקווים). (ג) כתוצאה רצף היתוך FP בבית 3'end של ENO1. אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
בזאת, אנו מציגים דוגמא של היתוך חלבון (Eno1-FP) מבנים במיני קנדידה. אנו משתמשים תיוג פלסמידים המכילים את הגן סמן טרנספורמציה NAT1 וכן רצפי קידוד GFP, YFP, אוmCherry (איור 2). פלסמידים אלה משמשים יחד עם פריימרים ב PCR כדי ליצור קלטות גן ספציפי המאפשרים שילוב של FPS כדי 3'-סוף ENO1, וכתוצאה מכך ביטוי Eno1 התמזגו fps ב carboxy הסופית- שלה.
איור 2: מפות של פלסמידים קלטת המכילה FP. קדמי (F) הפוך (R) פריימרים השתמשו כדי ליצור את הקלטות מן פלסמידים מסומנים יחד עם המיקום היחסי של ההומולוגיה שלהם פלסמידים. רצפים פריימר הם כמפורט בטבלה 1. F1 ו- R1 שימשו גם כדי ליצור את קלטת NAT1 pYFP-. הפלסמיד המכיל את הקלטת NAT1 YFP- (pMG2263) זהה pMG2120 למעט YFP במקום של רצף ה- GFP. בגדלים קלטת: GFP-NAT1, 3.7 KBP; mCherry- NAT1, 3.2 KBP; YFP- NAT1, 3.KBP 7. נתון זה יש הבדל בין Gerami-נג'אד, et al. 4 אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
בניית epitope מתויגת רצפים במיני קנדידה באמצעות אסטרטגיית שינוי הגנטית בתיווך PCR שתוארה לעיל ניתן לסכם כמו תהליך בן שלושה שלבים. ראשית, קלטת נעשית על ידי PCR מקודד הוא הרצף רצוי לשילוב ואזורים הומולוגי אל המוקד להכנסה לתוך הגנום שמרים. שנית, תאי שהמרים חייב להשתנות עש…
The authors have nothing to disclose.
אנו מודים נ דין למתן את רצף FP mCherry המקורי, מ 'Gerami-נג'אד לבנייה של פלסמידים, ב לארסון לקבלת סיוע טכני, וט Heisel עבור עצות מועילות במהלך הפיתוח של הפרויקט הזה. JB נתמכה על ידי בפרס מתקדם המועצה האירופית למחקר 340,087 (RAPLODAPT). מערכות מיקרוסקופיה הדמיה נמסרו על ידי אוניברסיטת קרן Pediatrics מינסוטה ואוניברסיטת מרכז הדמיה מינסוטה.
100W mercury lamp | CHIU Technical Corporation | M-100T | |
95% Ethanol | Any | NA | |
Adenine | Any | NA | |
Ampicillin | Any | NA | |
Carrier DNA | Ambion | AM9680 | Sheared Salmon Sperm DNA 10 mg/ml |
CCD Camera | Photometrics | CoolSNAP HQ | |
Conical Tube | Corning | 430828 | 50ml |
Culture Tube Rotator | New Brunswick | 2013923 | TC-8, or Any Culture Tube Rotator |
Deoxynucleotides (dNTP) PCR Grade | Any | NA | |
Eppendorf Tubes | Eppendorf | 022363719, 022363212 | 0.5ml, 1.5ml |
Erlenmeyer Flask | Fisher Scientific | 7250089 | 125ml |
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | Any | NA | |
Freezer (-80 °C ) | Thermo Electron Corporation | ULT-1386-9-V | Revco Ultima II |
GFP, YFP and Texas Red Filter Sets | Chroma Technology Corporation | 49002, 86004v2, 49008 | |
Glass culture tubes | Fisher Scientific | 1496126 | 75mm |
HRP goat anti-mouse antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-2005 | |
HRP goat anti-rabbit antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-2301 | |
Incubator (30 °C ) | Any | NA | |
Lithium Acetate | Any | NA | |
Lysogeny Broth (LB) Media | Any | NA | |
Magnesium Chloride | Any | NA | |
Microcentrifuge | Eppendorf | 5415 D | |
Microscope | Nikon | E600 | Nikon Eclipse E600 |
Microscope Image Analysis Software | Universal Imaging Corporation | 6.3r7 | MetaMorph Software Series 6.3r7 |
Mouse anti-GFP antibody | Roche | 11814460001 | |
Nourseothricin | Fisher Scientific | 50997939 | |
PCR Thermocycler | Applied Biosystems | 9700 | GeneAmp PCR System |
PCR tubes | BioExpress, GeneMate | T-3035-1 | 0.2ml |
Polyethylene Glycol 3350 | Any | NA | |
Potassium Chloride | Any | NA | |
Rabbit anti-mCherry antibody | BioVision | 5993-100 | |
Refrigerator (4°C) | Any | NA | |
Sodium Acetate | Any | NA | |
Stereomicroscope | Nikon | SMZ1500 | |
Table Top Centrifuge | Labnet | Z 400 | Hermle Z 400 |
Taq DNA Polymerase | Any | NA | |
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Any | NA | |
Vortex Mixer | Scientific Industries | SI-0236 | Vortex Genie 2 |
Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD) Media | Any | NA |