蛍光タンパク質融合物中の生成<em>カンジダ</em>種
Summary
PCRによる遺伝子改変は、酵母細胞およびタンパク質の可視化および定量化を容易にする、 カンジダ種で蛍光タンパク質融合体を生成するために使用することができます。ここで、我々は、 カンジダ・パラプシロシスに蛍光タンパク質融合（ENO1-FP）を構築するための方策を提示します。
Abstract
カンジダ種、腸管および尿生殖路の流行入植は、ヒトにおける侵襲性真菌感染症の大部分の原因となっています。このように、分子および遺伝子ツールは、それらの病因メカニズムの研究を促進するために必要とされています。 PCRによる遺伝子改変は、それらの検出を容易にするために、エピトープタグ融合タンパク質を生成する簡単かつ迅速なアプローチです。具体的には、蛍光タンパク質（FP）の融合体は、それぞれ、蛍光顕微鏡および免疫ブロッティングにより酵母細胞およびタンパク質の両方の可視化および定量化を可能にする強力なツールです。 FPをコードする配列を含むプラスミドは、 カンジダ種の形質転換を促進する栄養マーカー遺伝子と共に、 カンジダにおけるFPの構造および発現のために生成されています。ここで、我々は、 カンジダ種にFP融合を構築するための方策を提示します。ヌーセオスリシンresistaを含むプラスミドNCEの形質転換マーカー遺伝子（NAT1）、緑、黄、またはチェリーのFP（GFP、YFP、mCherryを）のいずれかのための配列は、FPカセットを生成するために、ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）で、遺伝子特異的な配列を含むプライマーと一緒に使用されるとともに。この遺伝子特異的カセットは、相同組換えを介して、対応する遺伝子座の3 '末端に統合する能力を有しています。関心対象の遺伝子座にFPシーケンスが正常にインフレーム融合は、顕微鏡および/または免疫検出法により、融合タンパク質発現の分析に続いて、遺伝的に検証されます。また、高度に発現されたタンパク質の場合について、成功した融合体は、主に蛍光イメージング技術によってスクリーニングすることができます。
Introduction
カンジダ種は、すべての人間の腸や尿生殖路を植民地化共生菌で。その結果として免疫不全の条件、早産または癌の治療の免疫抑制作用で発生する下では、 カンジダ種は、日和見病原体になることができます。 カンジダ種のうち、 カンジダ・アルビカンスは、最も一般的な真菌の植民あり、侵襲性真菌感染症の大部分の原因となります。このようなC.グラブラタ 、C。パラプシローシス 、C。トロピカリス 、Cのような他のカンジダ種は、また、いくつかの展示固有抵抗で、免疫不全患者で重篤な感染症を引き起こすkruseii一般的にしたがって、このようなフルコナゾールやアムホテリシンBのような抗真菌性抗生物質を使用しますこれらの種のいくつかの感染は、特に抗真菌剤で予防的に治療を受けている患者では、より頻繁に観察されています。でも適切かつタイムリーなAとNTI-真菌治療は、侵襲性カンジダ感染症はかなりの罹患率と死亡率1と関連することを続けています。しかし、人の健康におけるカンジダ種の意義、その病因機構の研究と解明を可能にする、容易に入手可能な分子ツールの必要性があります。
研究者が視覚化し、微生物細胞とそれらが発現するタンパク質を定量化することを可能にする一つの重要なツールは、FP融合技術です。ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）媒介遺伝子改変は、この論文に記載のように、FP配列、そのゲノム遺伝子座に目的の配列をコードカンジダタンパク質との間の融合物の構築を可能にします。構築物の安定な組込みは、タンパク質発現の解析だけでなく、タンパク質の局在のダイナミクスを容易にします。 FP配列を含むプラスミドは、 カンジダ・アルビカンスにおける発現のために最適化され、それは、PCR媒介Gで使用することができエン修飾戦略は、以前に2、3、4、5が構築されています。 C.アルビカンス及びC.パラプシローシス 2、3、4、5、6、7の変換を促進する栄養マーカー遺伝子に連結されたFPの配列：プラスミドはFP変換「カセット」を含みます。現在利用可能なプラスミドは選択可能な栄養栄養要求株の形質転換のためのマーカー遺伝子（URA3、HIS1、ARG4）だけでなく、栄養要求性を欠く臨床株の形質転換を容易に支配的な薬剤耐性マーカー（NAT1）、さまざまな含まれています。また、プラスミドは、最大4つの異なるFPシーケンス（緑[GFP]、YELLOのオプションが含まれています【YFP]ワット、シアン[CFP]、および桜[mCherryを]）およびカルボキシ末端タンパク質融合物の建設、またはアミノ末端タンパク質融合体の構築のためのプロモーター配列のためのADH1終結配列のいずれか。プライマーは、FPカセットを囲むプラスミドDNAの相同性を有するように設計されています。また、プライマーはまた、相同組換え（ 図1）を介してゲノム座にカセットの組込みを容易にタグ付けされるべき関心の酵母遺伝子に相同性をもつ5'-延長配列を含みます。遺伝子特異的FPカセットは、PCRによって生成され、酢酸リチウムで処理することによりDNAの取り込みのためにコンピテントカンジダ細胞に形質転換されます。
図1：FPシーケンス融合がカンジダ種にどのように生成されるかの図。 （A）プラスミドDNAはこちらよりエスFP配列および抵抗ヌーセオスリシンをコードする配列（NAT1）。フォワード（FWD）およびリバース（REV）プライマーの相対的位置は、プラスミド配列と相同性の領域を示すプライマーおよび遺伝子特異的相同領域またはプライマー伸長を示す紫色の部分の黒い部分で示されています。 （B）FPカセットは、 カンジダに形質転換し、相同組換え（点線）を介してENO1ゲノム遺伝子座の中に統合されています。 ENO1の3 '末端にFP融合配列を得られた（C）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
ここで、我々は、 カンジダ種におけるタンパク質融合（ENO1-FP）の構造の例を提示します。私たちは、GFP、YFPをコードする配列とともにNAT1の形質転換マーカー遺伝子を含むタグ付けするプラスミドを使用しますか、mCherryを（ 図2）。これらのプラスミドは、そのカルボキシ末端でのFPに融合ENO1の発現をもたらす、ENO1の3 '末端へのFPの融合を促進する遺伝子特異的カセットを生成するために、PCRにおけるプライマーと一緒に使用されています。
図2：FPカセットを含むプラスミドのマップ。フォワード（F）および逆方向（R）プラスミドからカセットを生成するために使用されるプライマーは、プラスミドに対する相同性の相対的な位置と共に示されています。 表1に記載されたプライマー配列です。 F1およびR1もpYFP- NAT1カセットを生成するために使用しました。 YFP- NAT1カセット （pMG2263）を含有するプラスミドは、GFP配列の代わりにYFPを除いてpMG2120と同じです。カセットサイズ：GFP-NAT1、3.7 kbpの。 mCherry- NAT1、3.2 kbpの。 YFP- NAT1、3。7 kbpの。この図は、Gerami-Nejad、 らから変更されています。 4 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Protocol
Representative Results
Discussion
エピトープの構造は、上述したPCRによる遺伝子改変戦略を使用してカンジダ種における配列は3段階のプロセスとして要約することができるタグを付けました。まず、カセットは、両方の酵母ゲノムへの挿入の遺伝子座に相同な統合および領域に対して所望の配列をコードするPCRによって行われます。次に、形質転換される酵母細胞は、酢酸リチウムと化学的にコンピテントにされ、カ…
Divulgazioni
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、元のmCherryをFPシーケンスを提供するためのN.ディーンに感謝、M. Gerami-Nejadプラスミドの構築のために、このプロジェクトの開発中に有益な助言のための技術支援のためのB.ラーソン、およびT. Heisel。 JBは、欧州研究評議会上級賞340087（RAPLODAPT）によってサポートされていました。顕微鏡およびイメージングシステムは、ミネソタ小児科財団の大学とミネソタイメージングセンターの大学によって提供されました。
Materials
| 100W mercury lamp | CHIU Technical Corporation | M-100T | |
| 95% Ethanol | Any | NA | |
| Adenine | Any | NA | |
| Ampicillin | Any | NA | |
| Carrier DNA | Ambion | AM9680 | Sheared Salmon Sperm DNA 10 mg/ml |
| CCD Camera | Photometrics | CoolSNAP HQ | |
| Conical Tube | Corning | 430828 | 50ml |
| Culture Tube Rotator | New Brunswick | 2013923 | TC-8, or Any Culture Tube Rotator |
| Deoxynucleotides (dNTP) PCR Grade | Any | NA | |
| Eppendorf Tubes | Eppendorf | 022363719, 022363212 | 0.5ml, 1.5ml |
| Erlenmeyer Flask | Fisher Scientific | 7250089 | 125ml |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | Any | NA | |
| Freezer (-80 °C ) | Thermo Electron Corporation | ULT-1386-9-V | Revco Ultima II |
| GFP, YFP and Texas Red Filter Sets | Chroma Technology Corporation | 49002, 86004v2, 49008 | |
| Glass culture tubes | Fisher Scientific | 1496126 | 75mm |
| HRP goat anti-mouse antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-2005 | |
| HRP goat anti-rabbit antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-2301 | |
| Incubator (30 °C ) | Any | NA | |
| Lithium Acetate | Any | NA | |
| Lysogeny Broth (LB) Media | Any | NA | |
| Magnesium Chloride | Any | NA | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415 D | |
| Microscope | Nikon | E600 | Nikon Eclipse E600 |
| Microscope Image Analysis Software | Universal Imaging Corporation | 6.3r7 | MetaMorph Software Series 6.3r7 |
| Mouse anti-GFP antibody | Roche | 11814460001 | |
| Nourseothricin | Fisher Scientific | 50997939 | |
| PCR Thermocycler | Applied Biosystems | 9700 | GeneAmp PCR System |
| PCR tubes | BioExpress, GeneMate | T-3035-1 | 0.2ml |
| Polyethylene Glycol 3350 | Any | NA | |
| Potassium Chloride | Any | NA | |
| Rabbit anti-mCherry antibody | BioVision | 5993-100 | |
| Refrigerator (4°C) | Any | NA | |
| Sodium Acetate | Any | NA | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1500 | |
| Table Top Centrifuge | Labnet | Z 400 | Hermle Z 400 |
| Taq DNA Polymerase | Any | NA | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Any | NA | |
| Vortex Mixer | Scientific Industries | SI-0236 | Vortex Genie 2 |
| Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD) Media | Any | NA |
Riferimenti
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